临床肝胆病杂志
臨床肝膽病雜誌
림상간담병잡지
CHINESE JOURNAL OF CLINICAL HEPATOLOGY
2012年
4期
289-295
,共7页
郑素军%邢欣悦%武聚山%王世美%张莹%韩源平%俞豪%陈煜%刘梅%段钟平
鄭素軍%邢訢悅%武聚山%王世美%張瑩%韓源平%俞豪%陳煜%劉梅%段鐘平
정소군%형흔열%무취산%왕세미%장형%한원평%유호%진욱%류매%단종평
Smad3 shRNA,慢病毒载体%肝硬化%转化生长因子β1%肝星状细胞
Smad3 shRNA,慢病毒載體%肝硬化%轉化生長因子β1%肝星狀細胞
Smad3 shRNA,만병독재체%간경화%전화생장인자β1%간성상세포
目的 观察Smad3 shRNA对TGFβ1作用于大鼠HSC - T6细胞增殖、细胞周期以及分泌肝纤维化胶原的影响.方法 Smad3 shRNA慢病毒感染HSC - T6,应用流式细胞仪检测其感染率,Real - time PCR检测对Smad3 mRNA表达的抑制作用；将HSC-T6对照、HSC - T6+ TGFβ1( 10 ng/ml)、Smad3 shRNA以及Smad3 shRNA+TGFβ1( 10 ng/ml)这4组细胞进行如下检测:(1)MTT检测细胞增殖；(2)流式细胞仪检测TGFβ1作用24、36 h细胞周期分布；(3)Real -time PCR检测24、36 h时细胞周期、增殖及肝纤维化相关基因mRNA的表达变化；(4)ELISA检测24、36 h培养液上清中胶原蛋白(COL)Ⅰ、COLⅢ及α- SMA的含量.结果 Smad3 shRNA慢病毒感染HSC - T6细胞至96h,感染率为71.3％,对Smad3 mRNA的表达抑制率为50％.(1) MTT结果显示,TGFβ1促进HSC - T6增殖；与相应未感染Smad3shRNA病毒组相比,Smad3 shRNA组以及Smad3 shRNA +TGFβ1组细胞增殖能力均下降.(2)细胞周期检测发现,24、36 h时,Smad3 shRNA+ TGFβ1组与Smad3 shRNA组相比,细胞周期分布差异无统计学意义(P＞0.05)；(3) Real - time PCR显示,Smad3 shRNA+ TGFβ1组较HSC - T6+ TGFβ1组,Smad3、原癌基因(c- myc)、细胞周期依赖性激酶-2(CDK-2)、细胞周期素E(cyclin E)、表皮生长因子(EGF)、核因子- κB( NF - κB)、金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)、纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、COLI及基质金属蛋白酶(MMP) 14等基因的mRNA在24、36 h表达均下调,HGF mRNA及COLⅢmRNA在24h时上调、36 h时下调,Bcl -2 mRNA、MMP1 mRNA及MMP9mRNA在24h和36 h两个时段均表达上调.(4) ELISA检测发现,同一时间点比较,分别在24、36 h,TGFβ1可促进HSC - T6细胞COL Ⅰ (P=0.00,P=0.02)、α- SMA( P =0.00,P=0.01)的分泌；与HSC -T6+TGFβ1组相比,Smad3 shRNA+ TGFβ1组COL Ⅰ于36 h分泌减少(P=0.00)、而α- SMA在24、36 h两个时间点分泌减少(P=0.00).结论 Smad3 shRNA抑制了TGFβ1对HSC - T6的活化,显示了抗肝纤维化作用.
目的 觀察Smad3 shRNA對TGFβ1作用于大鼠HSC - T6細胞增殖、細胞週期以及分泌肝纖維化膠原的影響.方法 Smad3 shRNA慢病毒感染HSC - T6,應用流式細胞儀檢測其感染率,Real - time PCR檢測對Smad3 mRNA錶達的抑製作用；將HSC-T6對照、HSC - T6+ TGFβ1( 10 ng/ml)、Smad3 shRNA以及Smad3 shRNA+TGFβ1( 10 ng/ml)這4組細胞進行如下檢測:(1)MTT檢測細胞增殖；(2)流式細胞儀檢測TGFβ1作用24、36 h細胞週期分佈；(3)Real -time PCR檢測24、36 h時細胞週期、增殖及肝纖維化相關基因mRNA的錶達變化；(4)ELISA檢測24、36 h培養液上清中膠原蛋白(COL)Ⅰ、COLⅢ及α- SMA的含量.結果 Smad3 shRNA慢病毒感染HSC - T6細胞至96h,感染率為71.3％,對Smad3 mRNA的錶達抑製率為50％.(1) MTT結果顯示,TGFβ1促進HSC - T6增殖；與相應未感染Smad3shRNA病毒組相比,Smad3 shRNA組以及Smad3 shRNA +TGFβ1組細胞增殖能力均下降.(2)細胞週期檢測髮現,24、36 h時,Smad3 shRNA+ TGFβ1組與Smad3 shRNA組相比,細胞週期分佈差異無統計學意義(P＞0.05)；(3) Real - time PCR顯示,Smad3 shRNA+ TGFβ1組較HSC - T6+ TGFβ1組,Smad3、原癌基因(c- myc)、細胞週期依賴性激酶-2(CDK-2)、細胞週期素E(cyclin E)、錶皮生長因子(EGF)、覈因子- κB( NF - κB)、金屬蛋白酶組織抑製劑-1(TIMP-1)、纖溶酶原激活物抑製劑-1(PAI-1)、α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、COLI及基質金屬蛋白酶(MMP) 14等基因的mRNA在24、36 h錶達均下調,HGF mRNA及COLⅢmRNA在24h時上調、36 h時下調,Bcl -2 mRNA、MMP1 mRNA及MMP9mRNA在24h和36 h兩箇時段均錶達上調.(4) ELISA檢測髮現,同一時間點比較,分彆在24、36 h,TGFβ1可促進HSC - T6細胞COL Ⅰ (P=0.00,P=0.02)、α- SMA( P =0.00,P=0.01)的分泌；與HSC -T6+TGFβ1組相比,Smad3 shRNA+ TGFβ1組COL Ⅰ于36 h分泌減少(P=0.00)、而α- SMA在24、36 h兩箇時間點分泌減少(P=0.00).結論 Smad3 shRNA抑製瞭TGFβ1對HSC - T6的活化,顯示瞭抗肝纖維化作用.
목적 관찰Smad3 shRNA대TGFβ1작용우대서HSC - T6세포증식、세포주기이급분비간섬유화효원적영향.방법 Smad3 shRNA만병독감염HSC - T6,응용류식세포의검측기감염솔,Real - time PCR검측대Smad3 mRNA표체적억제작용；장HSC-T6대조、HSC - T6+ TGFβ1( 10 ng/ml)、Smad3 shRNA이급Smad3 shRNA+TGFβ1( 10 ng/ml)저4조세포진행여하검측:(1)MTT검측세포증식；(2)류식세포의검측TGFβ1작용24、36 h세포주기분포；(3)Real -time PCR검측24、36 h시세포주기、증식급간섬유화상관기인mRNA적표체변화；(4)ELISA검측24、36 h배양액상청중효원단백(COL)Ⅰ、COLⅢ급α- SMA적함량.결과 Smad3 shRNA만병독감염HSC - T6세포지96h,감염솔위71.3％,대Smad3 mRNA적표체억제솔위50％.(1) MTT결과현시,TGFβ1촉진HSC - T6증식；여상응미감염Smad3shRNA병독조상비,Smad3 shRNA조이급Smad3 shRNA +TGFβ1조세포증식능력균하강.(2)세포주기검측발현,24、36 h시,Smad3 shRNA+ TGFβ1조여Smad3 shRNA조상비,세포주기분포차이무통계학의의(P＞0.05)；(3) Real - time PCR현시,Smad3 shRNA+ TGFβ1조교HSC - T6+ TGFβ1조,Smad3、원암기인(c- myc)、세포주기의뢰성격매-2(CDK-2)、세포주기소E(cyclin E)、표피생장인자(EGF)、핵인자- κB( NF - κB)、금속단백매조직억제제-1(TIMP-1)、섬용매원격활물억제제-1(PAI-1)、α평활기기동단백(α-SMA)、COLI급기질금속단백매(MMP) 14등기인적mRNA재24、36 h표체균하조,HGF mRNA급COLⅢmRNA재24h시상조、36 h시하조,Bcl -2 mRNA、MMP1 mRNA급MMP9mRNA재24h화36 h량개시단균표체상조.(4) ELISA검측발현,동일시간점비교,분별재24、36 h,TGFβ1가촉진HSC - T6세포COL Ⅰ (P=0.00,P=0.02)、α- SMA( P =0.00,P=0.01)적분비；여HSC -T6+TGFβ1조상비,Smad3 shRNA+ TGFβ1조COL Ⅰ우36 h분비감소(P=0.00)、이α- SMA재24、36 h량개시간점분비감소(P=0.00).결론 Smad3 shRNA억제료TGFβ1대HSC - T6적활화,현시료항간섬유화작용.
