CAJ | 학술논문

目的:观察密度梯度离心法结合贴壁法体外分离纯化培养人骨髓间充质干细胞的效果,以及诱导后的成人骨髓间充质干细胞的成骨特性.方法:实验于2005-05/09在中国协和医科大学中国医学科学院整形外科医院进行.用密度梯度离心法结合贴壁法分离纯化成人骨髓间充质干细胞.采用倒置显微镜观察,噻唑兰法测定细胞生长曲线,免疫细胞化学鉴定骨髓间充质干细胞膜抗原和细胞基质蛋白属性.取体外扩增的第3代骨髓间充质细胞,以3.0×103/cm2的浓度接种于放置有无菌处理的盖玻片的六孔板中,每孔内加2 mL含10%胎牛血清的低糖型DMEM培养基培养液.当细胞贴壁生长达到60%～70%汇合时,将培养基更换为含5%胎牛血清的低糖型DMEM培养液,其中含骨诱导剂地塞米松、抗坏血酸和β-磷酸甘油,浓度分别为:100 nmol/L、0.25 mmol/L、10 mmol/L.间充质细胞在这样的诱导体系中进行诱导培养,对照只加培养基.在第4、8、12、16天分别观察各孔中细胞的形态学和组织化学变化.体外加成骨诱导剂后分别作碱性磷酸酶活性测定、茜素红染色和Von Kossa染色,观察骨髓间充质干细胞的成骨分化结果.结果:①分离的骨髓间充质干细胞培养48 h后贴壁,72 h后出现纺锤状细胞,贴壁的骨髓间充质细胞平均约12 d后形成克隆.②第2代骨髓间充质干细胞99%表现为CD44+、Vim+、CD34-,CD29-.细胞表型稳定.③加成骨诱导剂后碱性磷酸酶活性明显增高,钙沉积在第8 d就开始出现,茜素红染色、Von Kossa染色阳性.结论:密度梯度离心法结合贴壁法分离纯化的成人骨髓间充质干细胞纯度高,表型稳定,体外加成骨诱导剂培养后,符合成骨细胞的形态特征和生物学特性,具有成骨活性,可为骨组织工程和基因治疗提供比较理想的种子细胞.
목적:관찰밀도제도리심법결합첩벽법체외분리순화배양인골수간충질간세포적효과,이급유도후적성인골수간충질간세포적성골특성.방법:실험우2005-05/09재중국협화의과대학중국의학과학원정형외과의원진행.용밀도제도리심법결합첩벽법분리순화성인골수간충질간세포.채용도치현미경관찰,새서란법측정세포생장곡선,면역세포화학감정골수간충질간세포막항원화세포기질단백속성.취체외확증적제3대골수간충질세포,이3.0×103/cm2적농도접충우방치유무균처리적개파편적륙공판중,매공내가2 mL함10%태우혈청적저당형DMEM배양기배양액.당세포첩벽생장체도60%～70%회합시,장배양기경환위함5%태우혈청적저당형DMEM배양액,기중함골유도제지새미송、항배혈산화β-린산감유,농도분별위:100 nmol/L、0.25 mmol/L、10 mmol/L.간충질세포재저양적유도체계중진행유도배양,대조지가배양기.재제4、8、12、16천분별관찰각공중세포적형태학화조직화학변화.체외가성골유도제후분별작감성린산매활성측정、천소홍염색화Von Kossa염색,관찰골수간충질간세포적성골분화결과.결과:①분리적골수간충질간세포배양48 h후첩벽,72 h후출현방추상세포,첩벽적골수간충질세포평균약12 d후형성극륭.②제2대골수간충질간세포99%표현위CD44+、Vim+、CD34-,CD29-.세포표형은정.③가성골유도제후감성린산매활성명현증고,개침적재제8 d취개시출현,천소홍염색、Von Kossa염색양성.결론:밀도제도리심법결합첩벽법분리순화적성인골수간충질간세포순도고,표형은정,체외가성골유도제배양후,부합성골세포적형태특정화생물학특성,구유성골활성,가위골조직공정화기인치료제공비교이상적충자세포.