生物技术通讯
生物技術通訊
생물기술통신
LETTERS IN BIOTECHNOLOGY
2011年
5期
647-650,666
,共5页
李丹丹%李英%吴小桃%鲁云霞%王学军%王升启
李丹丹%李英%吳小桃%魯雲霞%王學軍%王升啟
리단단%리영%오소도%로운하%왕학군%왕승계
Avi-tag%增强型绿色荧光蛋白%BirA酶%人胚肾细胞%亲和纯化
Avi-tag%增彊型綠色熒光蛋白%BirA酶%人胚腎細胞%親和純化
Avi-tag%증강형록색형광단백%BirA매%인배신세포%친화순화
目的:建立并优化基于Avi-tag标签技术的人胚肾细胞增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的定点生物素化标记、纯化和检测方法.方法:分别构建具有Avi-tag标签的eGFP真核表达载体plenti-Avi-eGFP和BirA酶真核过表达载体pQCXIH-BirA,将plenti-Avi-eGFP和pQCXIH-BirA共转染人胚肾293T细胞,12 h后观察Avi-tag标签对eGFP蛋白在细胞内定位的影响；48 h后裂解细胞,用链霉亲和素珠子纯化生物素标记的eGFP,SDS-PAGE观察eGFP纯化和富集情况,并优化基于Western印迹的生物素化eGFP检测方法.结果:Avi-tag标签对eGFP在细胞内的定位无影响,同时BirA酶在293T细胞内可将带Avi-tag标签的eGFP标记上生物素；生物素化的eGFP可特异性地被链霉亲和素珠子纯化和富集,纯度可达95%；Western印迹检测生物素化蛋白的最终条件为5%的BSA作为封闭液和终浓度为100 ng/mL的链霉亲和素-HRP.结论:建立了基于Avi-tag技术的人胚肾细胞内增强型绿色荧光蛋白的生物素化标记、纯化与检测方法,为该方法的广泛应用奠定了前期技术基础.
目的:建立併優化基于Avi-tag標籤技術的人胚腎細胞增彊型綠色熒光蛋白(eGFP)的定點生物素化標記、純化和檢測方法.方法:分彆構建具有Avi-tag標籤的eGFP真覈錶達載體plenti-Avi-eGFP和BirA酶真覈過錶達載體pQCXIH-BirA,將plenti-Avi-eGFP和pQCXIH-BirA共轉染人胚腎293T細胞,12 h後觀察Avi-tag標籤對eGFP蛋白在細胞內定位的影響；48 h後裂解細胞,用鏈黴親和素珠子純化生物素標記的eGFP,SDS-PAGE觀察eGFP純化和富集情況,併優化基于Western印跡的生物素化eGFP檢測方法.結果:Avi-tag標籤對eGFP在細胞內的定位無影響,同時BirA酶在293T細胞內可將帶Avi-tag標籤的eGFP標記上生物素；生物素化的eGFP可特異性地被鏈黴親和素珠子純化和富集,純度可達95%；Western印跡檢測生物素化蛋白的最終條件為5%的BSA作為封閉液和終濃度為100 ng/mL的鏈黴親和素-HRP.結論:建立瞭基于Avi-tag技術的人胚腎細胞內增彊型綠色熒光蛋白的生物素化標記、純化與檢測方法,為該方法的廣汎應用奠定瞭前期技術基礎.
목적:건립병우화기우Avi-tag표첨기술적인배신세포증강형록색형광단백(eGFP)적정점생물소화표기、순화화검측방법.방법:분별구건구유Avi-tag표첨적eGFP진핵표체재체plenti-Avi-eGFP화BirA매진핵과표체재체pQCXIH-BirA,장plenti-Avi-eGFP화pQCXIH-BirA공전염인배신293T세포,12 h후관찰Avi-tag표첨대eGFP단백재세포내정위적영향；48 h후렬해세포,용련매친화소주자순화생물소표기적eGFP,SDS-PAGE관찰eGFP순화화부집정황,병우화기우Western인적적생물소화eGFP검측방법.결과:Avi-tag표첨대eGFP재세포내적정위무영향,동시BirA매재293T세포내가장대Avi-tag표첨적eGFP표기상생물소；생물소화적eGFP가특이성지피련매친화소주자순화화부집,순도가체95%；Western인적검측생물소화단백적최종조건위5%적BSA작위봉폐액화종농도위100 ng/mL적련매친화소-HRP.결론:건립료기우Avi-tag기술적인배신세포내증강형록색형광단백적생물소화표기、순화여검측방법,위해방법적엄범응용전정료전기기술기출.
