实用儿科临床杂志
實用兒科臨床雜誌
실용인과림상잡지
Journal of Applied Clinical Pediatrics
2011年
10期
736-738
,共3页
崔鑫%任高伟%王桂丽%齐莹%马艳萍%阮强%孙峥嵘
崔鑫%任高偉%王桂麗%齊瑩%馬豔萍%阮彊%孫崢嶸
최흠%임고위%왕계려%제형%마염평%원강%손쟁영
人巨细胞病毒%UL133蛋白%酵母双杂交系统%人胎脑cDNA文库
人巨細胞病毒%UL133蛋白%酵母雙雜交繫統%人胎腦cDNA文庫
인거세포병독%UL133단백%효모쌍잡교계통%인태뇌cDNA문고
目的 应用酵母双杂交技术筛选人胎脑cDNA文库中与人巨细胞病毒(HCMV)UL/b′ UL133编码蛋白相互作用的蛋白,为研究UL/b′编码蛋白的生物学功能,揭示HCMV先天感染的致病机制奠定基础.方法 设计特异性引物,在引物上下游分别引入NdeⅠ和BamHⅠ限制性内切酶识别位点,采用PCR技术扩增 HCMV临床分离株H株的UL133基因片段,将其扩增产物与载体pGBKT7 同时使用NdeⅠ和BamHⅠ进行双酶切,纯化后,将UL133片段插入到pGBKT7载体上,构建诱饵质粒 pGBKT7-UL133,并测序分析.利用醋酸锂小量酵母转化方法,将测序正确的诱饵质粒pGBKT7-UL133转化入AH109酵母感受态细胞中,然后将转化的菌液涂布在色氨酸缺陷型培养基(-Trp)上,筛选阳性菌落.再将人胎脑cDNA文库质粒转化到含pGBKT7-UL133质粒的AH109菌株中,在四缺培养基(-Ade/-His/-Leu/-Trp)中筛选,在铺有X-Gal的滤纸上进行显色反应,提取显蓝色的阳性酵母筛选质粒,运用电穿孔方法将其转化到TG1的大肠杆菌中,并行PCR鉴定,提取大肠杆菌中的文库质粒,并将其回转到含诱饵质粒pGBKT7-UL133 的酵母菌株中,进行回转验证.对筛选到的阳性克隆进行测序和生物信息学分析.结果 用于酵母双杂交筛选的诱饵质粒pGBKT7-UL133成功构建,含有诱饵质粒的酵母菌株在-Trp上生长.转化有人胎脑cDNA文库和诱饵质粒pGBKT7-UL133的酵母菌AH109,在四缺培养基中观察到有28个酵母菌落生长,通过显色反应、酵母质粒转化及回转酵母细胞筛选得到4个阳性克隆.通过序列比对,发现在这些基因中,其中一个基因编码人类还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)依赖性氧化还原酶1.结论 成功应用酵母双杂交系统筛选出与HCMV UL/b′区UL133编码蛋白相互作用的蛋白-NADPH,提示UL133蛋白可能在增加病毒毒力和传染性,干扰细胞间的信号传导和细胞的生长、分裂、凋亡等方面发挥重要作用.
目的 應用酵母雙雜交技術篩選人胎腦cDNA文庫中與人巨細胞病毒(HCMV)UL/b′ UL133編碼蛋白相互作用的蛋白,為研究UL/b′編碼蛋白的生物學功能,揭示HCMV先天感染的緻病機製奠定基礎.方法 設計特異性引物,在引物上下遊分彆引入NdeⅠ和BamHⅠ限製性內切酶識彆位點,採用PCR技術擴增 HCMV臨床分離株H株的UL133基因片段,將其擴增產物與載體pGBKT7 同時使用NdeⅠ和BamHⅠ進行雙酶切,純化後,將UL133片段插入到pGBKT7載體上,構建誘餌質粒 pGBKT7-UL133,併測序分析.利用醋痠鋰小量酵母轉化方法,將測序正確的誘餌質粒pGBKT7-UL133轉化入AH109酵母感受態細胞中,然後將轉化的菌液塗佈在色氨痠缺陷型培養基(-Trp)上,篩選暘性菌落.再將人胎腦cDNA文庫質粒轉化到含pGBKT7-UL133質粒的AH109菌株中,在四缺培養基(-Ade/-His/-Leu/-Trp)中篩選,在鋪有X-Gal的濾紙上進行顯色反應,提取顯藍色的暘性酵母篩選質粒,運用電穿孔方法將其轉化到TG1的大腸桿菌中,併行PCR鑒定,提取大腸桿菌中的文庫質粒,併將其迴轉到含誘餌質粒pGBKT7-UL133 的酵母菌株中,進行迴轉驗證.對篩選到的暘性剋隆進行測序和生物信息學分析.結果 用于酵母雙雜交篩選的誘餌質粒pGBKT7-UL133成功構建,含有誘餌質粒的酵母菌株在-Trp上生長.轉化有人胎腦cDNA文庫和誘餌質粒pGBKT7-UL133的酵母菌AH109,在四缺培養基中觀察到有28箇酵母菌落生長,通過顯色反應、酵母質粒轉化及迴轉酵母細胞篩選得到4箇暘性剋隆.通過序列比對,髮現在這些基因中,其中一箇基因編碼人類還原型煙酰胺腺嘌呤二覈苷痠燐痠(NADPH)依賴性氧化還原酶1.結論 成功應用酵母雙雜交繫統篩選齣與HCMV UL/b′區UL133編碼蛋白相互作用的蛋白-NADPH,提示UL133蛋白可能在增加病毒毒力和傳染性,榦擾細胞間的信號傳導和細胞的生長、分裂、凋亡等方麵髮揮重要作用.
목적 응용효모쌍잡교기술사선인태뇌cDNA문고중여인거세포병독(HCMV)UL/b′ UL133편마단백상호작용적단백,위연구UL/b′편마단백적생물학공능,게시HCMV선천감염적치병궤제전정기출.방법 설계특이성인물,재인물상하유분별인입NdeⅠ화BamHⅠ한제성내절매식별위점,채용PCR기술확증 HCMV림상분리주H주적UL133기인편단,장기확증산물여재체pGBKT7 동시사용NdeⅠ화BamHⅠ진행쌍매절,순화후,장UL133편단삽입도pGBKT7재체상,구건유이질립 pGBKT7-UL133,병측서분석.이용작산리소량효모전화방법,장측서정학적유이질립pGBKT7-UL133전화입AH109효모감수태세포중,연후장전화적균액도포재색안산결함형배양기(-Trp)상,사선양성균락.재장인태뇌cDNA문고질립전화도함pGBKT7-UL133질립적AH109균주중,재사결배양기(-Ade/-His/-Leu/-Trp)중사선,재포유X-Gal적려지상진행현색반응,제취현람색적양성효모사선질립,운용전천공방법장기전화도TG1적대장간균중,병행PCR감정,제취대장간균중적문고질립,병장기회전도함유이질립pGBKT7-UL133 적효모균주중,진행회전험증.대사선도적양성극륭진행측서화생물신식학분석.결과 용우효모쌍잡교사선적유이질립pGBKT7-UL133성공구건,함유유이질립적효모균주재-Trp상생장.전화유인태뇌cDNA문고화유이질립pGBKT7-UL133적효모균AH109,재사결배양기중관찰도유28개효모균락생장,통과현색반응、효모질립전화급회전효모세포사선득도4개양성극륭.통과서렬비대,발현재저사기인중,기중일개기인편마인류환원형연선알선표령이핵감산린산(NADPH)의뢰성양화환원매1.결론 성공응용효모쌍잡교계통사선출여HCMV UL/b′구UL133편마단백상호작용적단백-NADPH,제시UL133단백가능재증가병독독력화전염성,간우세포간적신호전도화세포적생장、분렬、조망등방면발휘중요작용.
