军事医学科学院院刊
軍事醫學科學院院刊
군사의학과학원원간
BULLETIN OF THE ACADEMY OF MILITARY MEDICAL SCIENCES
2010年
2期
123-126
,共4页
高宁%绳纪坡%于芳%林宇翔%马祖兴%胡宝成
高寧%繩紀坡%于芳%林宇翔%馬祖興%鬍寶成
고저%승기파%우방%림우상%마조흥%호보성
MEPE/OF45%基因表达%细胞系%DNA损伤
MEPE/OF45%基因錶達%細胞繫%DNA損傷
MEPE/OF45%기인표체%세포계%DNA손상
目的 构建人MEPE基因真核表达载体,稳定转染人胚肾293T细胞,并建立稳定表达细胞株;初步探讨人MEPE蛋白在DNA损伤应答中的作用.方法 将人MEPE cDNA克隆至带有HA标签的真核表达载体pREP10上,构建重组质粒;分别将载体pREP10/MEPE-HA和pREP10/HA转染293T细胞;经潮霉素B加压筛选阳性克隆;用RT-PCR和免疫印迹方法分别在RNA水平和蛋白水平鉴定稳定表达MEPE-HA融合蛋白的阳性细胞株;利用一定浓度的DNA损伤诱导剂喜树碱(camptothecin, CPT)处理细胞,通过MTT比色法检测不同时间点细胞存活率的变化,其趋势即可反映出不同细胞株对DNA损伤诱导剂的敏感性.结果 经酶切鉴定及序列分析,人MEPE基因真核表达载体pREP10/MEPE-HA构建正确,转染人293T细胞,筛选出MEPE表达较高的细胞株,并且发现该基因的高表达可以使细胞对DNA损伤诱导剂的耐受性提高.结论 成功建立了稳定表达人MEPE的293T细胞株,并对人MEPE蛋白在细胞中对DNA损伤诱导剂敏感性的影响进行了初步探讨,为进一步研究MEPE的功能奠定了基础.
目的 構建人MEPE基因真覈錶達載體,穩定轉染人胚腎293T細胞,併建立穩定錶達細胞株;初步探討人MEPE蛋白在DNA損傷應答中的作用.方法 將人MEPE cDNA剋隆至帶有HA標籤的真覈錶達載體pREP10上,構建重組質粒;分彆將載體pREP10/MEPE-HA和pREP10/HA轉染293T細胞;經潮黴素B加壓篩選暘性剋隆;用RT-PCR和免疫印跡方法分彆在RNA水平和蛋白水平鑒定穩定錶達MEPE-HA融閤蛋白的暘性細胞株;利用一定濃度的DNA損傷誘導劑喜樹堿(camptothecin, CPT)處理細胞,通過MTT比色法檢測不同時間點細胞存活率的變化,其趨勢即可反映齣不同細胞株對DNA損傷誘導劑的敏感性.結果 經酶切鑒定及序列分析,人MEPE基因真覈錶達載體pREP10/MEPE-HA構建正確,轉染人293T細胞,篩選齣MEPE錶達較高的細胞株,併且髮現該基因的高錶達可以使細胞對DNA損傷誘導劑的耐受性提高.結論 成功建立瞭穩定錶達人MEPE的293T細胞株,併對人MEPE蛋白在細胞中對DNA損傷誘導劑敏感性的影響進行瞭初步探討,為進一步研究MEPE的功能奠定瞭基礎.
목적 구건인MEPE기인진핵표체재체,은정전염인배신293T세포,병건립은정표체세포주;초보탐토인MEPE단백재DNA손상응답중적작용.방법 장인MEPE cDNA극륭지대유HA표첨적진핵표체재체pREP10상,구건중조질립;분별장재체pREP10/MEPE-HA화pREP10/HA전염293T세포;경조매소B가압사선양성극륭;용RT-PCR화면역인적방법분별재RNA수평화단백수평감정은정표체MEPE-HA융합단백적양성세포주;이용일정농도적DNA손상유도제희수감(camptothecin, CPT)처리세포,통과MTT비색법검측불동시간점세포존활솔적변화,기추세즉가반영출불동세포주대DNA손상유도제적민감성.결과 경매절감정급서렬분석,인MEPE기인진핵표체재체pREP10/MEPE-HA구건정학,전염인293T세포,사선출MEPE표체교고적세포주,병차발현해기인적고표체가이사세포대DNA손상유도제적내수성제고.결론 성공건립료은정표체인MEPE적293T세포주,병대인MEPE단백재세포중대DNA손상유도제민감성적영향진행료초보탐토,위진일보연구MEPE적공능전정료기출.
