CAJ | 학술논문

[目的]以毕赤酵母(Pichia pastoris)X33为宿主菌高效表达黑曲霉(Aspergillus niger)糖化酶,为进一步扩大糖化酶在工业上的应用奠定基础.[方法]利用RT-PCR技术,提取黑曲霉总RNA进行反转录,以得到的cDNA为模板,根据NCBI数据库中A.niger CBS513.88糖化酶的cDNA序列(glaA)设计引物,通过PCR扩增得到去除天然信号肽的糖化酶成熟肽编码基因glaAm,并将其克隆到pUC19载体中,序列分析表明,glaAm的开放阅读框由1 879个核苷酸组成,编码625个氨基酸.以此片段构建了pFLDα-glaAm重组表达载体,经Nsi I线性化后,电击转化毕赤酵母X-33.摇瓶培养中通过添加终浓度为0.5%的甲醇诱导糖化酶的分泌.[结果]SDS-PAGE和Starch-PAGE显示,糖化酶得到正确的分泌表达,且具有较高的生物活性,发酵上清液中酶活最高达到380.78 U/ml(发酵液).重组糖化酶的最适反应温度和最适pH分别为60～65℃和4.0,在pH 2.5～5.5范围内均保持90%以上的酶活力.该酶具有较高的热稳定性,pH 4.0条件下,该酶在50℃下稳定;60℃处理60 min,仍能保持90%以上的酶活力;65℃下的半衰期约为44 min.[结论]黑曲霉糖化酶基因在毕赤酵母X33中得到了异源高效表达.
[목적]이필적효모(Pichia pastoris)X33위숙주균고효표체흑곡매(Aspergillus niger)당화매,위진일보확대당화매재공업상적응용전정기출.[방법]이용RT-PCR기술,제취흑곡매총RNA진행반전록,이득도적cDNA위모판,근거NCBI수거고중A.niger CBS513.88당화매적cDNA서렬(glaA)설계인물,통과PCR확증득도거제천연신호태적당화매성숙태편마기인glaAm,병장기극륭도pUC19재체중,서렬분석표명,glaAm적개방열독광유1 879개핵감산조성,편마625개안기산.이차편단구건료pFLDα-glaAm중조표체재체,경Nsi I선성화후,전격전화필적효모X-33.요병배양중통과첨가종농도위0.5%적갑순유도당화매적분비.[결과]SDS-PAGE화Starch-PAGE현시,당화매득도정학적분비표체,차구유교고적생물활성,발효상청액중매활최고체도380.78 U/ml(발효액).중조당화매적최괄반응온도화최괄pH분별위60～65℃화4.0,재pH 2.5～5.5범위내균보지90%이상적매활력.해매구유교고적열은정성,pH 4.0조건하,해매재50℃하은정;60℃처리60 min,잉능보지90%이상적매활력;65℃하적반쇠기약위44 min.[결론]흑곡매당화매기인재필적효모X33중득도료이원고효표체.