中山大学学报（自然科学版）
中山大學學報（自然科學版）
중산대학학보（자연과학판）
ACTA SCIENTIARUM NATURALIUM UNIVERSITATIS SUNYATSENI
2011年
5期
93-99
,共7页
徐祖敏%程锐%杨霞%杨中汉%刘少军%黎明涛%蔡卫斌%高国全
徐祖敏%程銳%楊霞%楊中漢%劉少軍%黎明濤%蔡衛斌%高國全
서조민%정예%양하%양중한%류소군%려명도%채위빈%고국전
基因工程%重组蛋白%蛋白质结构%二硫键%基质辅助激光解析电离飞行时间质谱
基因工程%重組蛋白%蛋白質結構%二硫鍵%基質輔助激光解析電離飛行時間質譜
기인공정%중조단백%단백질결구%이류건%기질보조격광해석전리비행시간질보
以Kringle环为分子模型,应用MALDI-TOF/MS联合特异性蛋白酶酶切技术,探讨建立蛋白质二硫键分布和定位分析的研究方法.采用pET22b(+)原核表达体系诱导表达重组人纤溶酶原K5蛋白(rhK5),经Ni2+ - NTA resin亲和层析纯化,并通过SDS-PAGE和Western-blot进行初步鉴定；采用MTT法分析rhK5对微血管内皮细胞的抑制活性；联合应用交叉酶切(Trypsin Gold单切或Trypsin Gold及Endoproteinase ASP-N双酶切)和基质辅助激光解析-飞行时间质谱(MALDI-TOF/MS)分析rhK5的二硫键分布；并应用生物信息学方法和圆二色谱法进一步验证rhK5二级结构.应用原核体系高效表达具有生物活性的rhK5蛋白,经交叉酶切联合MAL-DI-TOF/MS证实rhK5中的6个半胱氨酸正确配对形成了3对二硫键(Cys462:541,Cys483:524和Cys512:536),圆二色谱法测定发现rhK5为典型的β折叠型结构.上述研究结果为分析基因工程重组蛋白质中半胱氨酸配对及二硫键分布提供了方法学基础.
以Kringle環為分子模型,應用MALDI-TOF/MS聯閤特異性蛋白酶酶切技術,探討建立蛋白質二硫鍵分佈和定位分析的研究方法.採用pET22b(+)原覈錶達體繫誘導錶達重組人纖溶酶原K5蛋白(rhK5),經Ni2+ - NTA resin親和層析純化,併通過SDS-PAGE和Western-blot進行初步鑒定；採用MTT法分析rhK5對微血管內皮細胞的抑製活性；聯閤應用交扠酶切(Trypsin Gold單切或Trypsin Gold及Endoproteinase ASP-N雙酶切)和基質輔助激光解析-飛行時間質譜(MALDI-TOF/MS)分析rhK5的二硫鍵分佈；併應用生物信息學方法和圓二色譜法進一步驗證rhK5二級結構.應用原覈體繫高效錶達具有生物活性的rhK5蛋白,經交扠酶切聯閤MAL-DI-TOF/MS證實rhK5中的6箇半胱氨痠正確配對形成瞭3對二硫鍵(Cys462:541,Cys483:524和Cys512:536),圓二色譜法測定髮現rhK5為典型的β摺疊型結構.上述研究結果為分析基因工程重組蛋白質中半胱氨痠配對及二硫鍵分佈提供瞭方法學基礎.
이Kringle배위분자모형,응용MALDI-TOF/MS연합특이성단백매매절기술,탐토건립단백질이류건분포화정위분석적연구방법.채용pET22b(+)원핵표체체계유도표체중조인섬용매원K5단백(rhK5),경Ni2+ - NTA resin친화층석순화,병통과SDS-PAGE화Western-blot진행초보감정；채용MTT법분석rhK5대미혈관내피세포적억제활성；연합응용교차매절(Trypsin Gold단절혹Trypsin Gold급Endoproteinase ASP-N쌍매절)화기질보조격광해석-비행시간질보(MALDI-TOF/MS)분석rhK5적이류건분포；병응용생물신식학방법화원이색보법진일보험증rhK5이급결구.응용원핵체계고효표체구유생물활성적rhK5단백,경교차매절연합MAL-DI-TOF/MS증실rhK5중적6개반광안산정학배대형성료3대이류건(Cys462:541,Cys483:524화Cys512:536),원이색보법측정발현rhK5위전형적β절첩형결구.상술연구결과위분석기인공정중조단백질중반광안산배대급이류건분포제공료방법학기출.
