药学学报
藥學學報
약학학보
ACTA PHARMACEUTICA SINICA
2008年
7期
766-772
,共7页
高伟%崔光红%孔建强%程克棣%王伟%袁媛%黄璐琦
高偉%崔光紅%孔建彊%程剋棣%王偉%袁媛%黃璐琦
고위%최광홍%공건강%정극체%왕위%원원%황로기
丹参%柯巴基焦磷酸合酶%优化表达%抗体制备
丹參%柯巴基焦燐痠閤酶%優化錶達%抗體製備
단삼%가파기초린산합매%우화표체%항체제비
用含丹参柯巴基焦磷酸合酶(Salvia miltiorrhiza copalyl diphosphate synthase, SmCPS)基因的重组质粒pET32CPS转化大肠杆菌BL21trxB(DE3)进行诱导表达,SDS-PAGE结果表明SmCPS基因在大肠杆菌中获得了表达;对影响可溶性表达的4个因素,即诱导温度、IPTG诱导浓度、诱导时宿主菌的密度(A600)和诱导时间进行了优化.结果发现在宿主菌A600达到1.0时加入0.4mmol·L-1 IPTG,在20℃诱导培养8h表达的可溶性蛋白量最高,约占细胞总蛋白的35.6%.用Ni2+亲和色谱法纯化表达产物,纯化蛋白产率达到12.3mg·L-1.将纯化蛋白免疫制备兔源SmCPS抗血清,ELISA测定效价为1:24300,且经Western blotting鉴定该抗体可特异性识别SmCPS抗原,获得了效价高、免疫反应性好的SmCPS多克隆抗体,为进一步从蛋白水平研究SmCPS表达与丹参酮类有效成分生物合成相关性提供了物质基础.
用含丹參柯巴基焦燐痠閤酶(Salvia miltiorrhiza copalyl diphosphate synthase, SmCPS)基因的重組質粒pET32CPS轉化大腸桿菌BL21trxB(DE3)進行誘導錶達,SDS-PAGE結果錶明SmCPS基因在大腸桿菌中穫得瞭錶達;對影響可溶性錶達的4箇因素,即誘導溫度、IPTG誘導濃度、誘導時宿主菌的密度(A600)和誘導時間進行瞭優化.結果髮現在宿主菌A600達到1.0時加入0.4mmol·L-1 IPTG,在20℃誘導培養8h錶達的可溶性蛋白量最高,約佔細胞總蛋白的35.6%.用Ni2+親和色譜法純化錶達產物,純化蛋白產率達到12.3mg·L-1.將純化蛋白免疫製備兔源SmCPS抗血清,ELISA測定效價為1:24300,且經Western blotting鑒定該抗體可特異性識彆SmCPS抗原,穫得瞭效價高、免疫反應性好的SmCPS多剋隆抗體,為進一步從蛋白水平研究SmCPS錶達與丹參酮類有效成分生物閤成相關性提供瞭物質基礎.
용함단삼가파기초린산합매(Salvia miltiorrhiza copalyl diphosphate synthase, SmCPS)기인적중조질립pET32CPS전화대장간균BL21trxB(DE3)진행유도표체,SDS-PAGE결과표명SmCPS기인재대장간균중획득료표체;대영향가용성표체적4개인소,즉유도온도、IPTG유도농도、유도시숙주균적밀도(A600)화유도시간진행료우화.결과발현재숙주균A600체도1.0시가입0.4mmol·L-1 IPTG,재20℃유도배양8h표체적가용성단백량최고,약점세포총단백적35.6%.용Ni2+친화색보법순화표체산물,순화단백산솔체도12.3mg·L-1.장순화단백면역제비토원SmCPS항혈청,ELISA측정효개위1:24300,차경Western blotting감정해항체가특이성식별SmCPS항원,획득료효개고、면역반응성호적SmCPS다극륭항체,위진일보종단백수평연구SmCPS표체여단삼동류유효성분생물합성상관성제공료물질기출.
