血栓与止血学
血栓與止血學
혈전여지혈학
CHINESE JOURNAL OF THROMBOSIS AND HEMOSTASIS
2010年
5期
198-205,215
,共9页
吴瑛婷%丁秋兰%戴菁%陆晔玲%奚晓东%王学锋%王鸿利
吳瑛婷%丁鞦蘭%戴菁%陸曄玲%奚曉東%王學鋒%王鴻利
오영정%정추란%대정%륙엽령%해효동%왕학봉%왕홍리
蛋白C%复合杂合基因突变%蛋白C缺陷症
蛋白C%複閤雜閤基因突變%蛋白C缺陷癥
단백C%복합잡합기인돌변%단백C결함증
目的 对2个复合杂合的蛋白C(PC)基因突变致静脉血栓的家系进行临床表型、基因型和分子发病机制的研究.方法 对血浆蛋白C活性(PC:A)和抗原(PC:Ag)分别用发色底物法和ELISA法进行测定,以凝血酶生成试验检测患者凝血功能的变化.PCR法扩增先证者PC基因的9个外显子及其侧翼序列,PCR产物纯化后直接测序,检测其基因突变.RT-PCR法结合定点突变法构建PC基因野生型和突变型表达质粒(PC wt、PC R178W、PC D255H、PC L-34P、PC T295I),瞬时转染COS-7细胞,检测细胞内、外PC:Ag的含量.利用细胞免疫荧光染色观察内质网和高尔基体中PC蛋白的定位.结果 先证者1,28岁青年男性,临床诊断为下肢深静脉血栓和肺栓塞,PC:A 21%,PC:Ag 18.36%,为I型蛋白C缺陷症,基因分析显示在其PC基因7号和9号外显子分别存在R178W和D255H的复合杂合突变,其中D255H来自其父亲;先证者2,男,16岁,PC:A 21%,PC:Ag 20.04%,Ⅰ型PC缺陷症,在其PC基因的2号和9号外显子分别存在L-34P和T295I的复合杂合突变,其中L-34P来自其母亲,T295I来自其父亲.凝血酶生成试验显示其父母的抗凝功能减弱,凝血酶调节蛋白(TM)抑制凝血酶生成的能力降低.体外表达研究显示,PCL-34P只有7%分泌至细胞外,细胞内PC:Ag也只有8.72%,说明存在严重的分泌障碍和细胞内降解加速现象;PCR178W只有极少量(8%)从细胞内分泌,而PCD255H和PCT295I分别有57%和34%分泌至细胞外,细胞内PC:Ag含量分别是44.38%、38.05%和61.57%.细胞免疫荧光染色显示,PCT295I突变蛋白在内质网中滞留,在高尔基体中定位减少导致分泌减少.结论 复合杂合性PC基因突变(R178W和D255H、L-34P和T295I)是导致此两例先证者1型遗传性PC缺陷症的原因.R178W、D255H、L-34P是国内首次报道的PC基因突变,T295I是国际首次报道的PC基因突变,分泌障碍和细胞内降解是R178W、D255H、L-34P和T295I导致PC缺陷症的分子机制.
目的 對2箇複閤雜閤的蛋白C(PC)基因突變緻靜脈血栓的傢繫進行臨床錶型、基因型和分子髮病機製的研究.方法 對血漿蛋白C活性(PC:A)和抗原(PC:Ag)分彆用髮色底物法和ELISA法進行測定,以凝血酶生成試驗檢測患者凝血功能的變化.PCR法擴增先證者PC基因的9箇外顯子及其側翼序列,PCR產物純化後直接測序,檢測其基因突變.RT-PCR法結閤定點突變法構建PC基因野生型和突變型錶達質粒(PC wt、PC R178W、PC D255H、PC L-34P、PC T295I),瞬時轉染COS-7細胞,檢測細胞內、外PC:Ag的含量.利用細胞免疫熒光染色觀察內質網和高爾基體中PC蛋白的定位.結果 先證者1,28歲青年男性,臨床診斷為下肢深靜脈血栓和肺栓塞,PC:A 21%,PC:Ag 18.36%,為I型蛋白C缺陷癥,基因分析顯示在其PC基因7號和9號外顯子分彆存在R178W和D255H的複閤雜閤突變,其中D255H來自其父親;先證者2,男,16歲,PC:A 21%,PC:Ag 20.04%,Ⅰ型PC缺陷癥,在其PC基因的2號和9號外顯子分彆存在L-34P和T295I的複閤雜閤突變,其中L-34P來自其母親,T295I來自其父親.凝血酶生成試驗顯示其父母的抗凝功能減弱,凝血酶調節蛋白(TM)抑製凝血酶生成的能力降低.體外錶達研究顯示,PCL-34P隻有7%分泌至細胞外,細胞內PC:Ag也隻有8.72%,說明存在嚴重的分泌障礙和細胞內降解加速現象;PCR178W隻有極少量(8%)從細胞內分泌,而PCD255H和PCT295I分彆有57%和34%分泌至細胞外,細胞內PC:Ag含量分彆是44.38%、38.05%和61.57%.細胞免疫熒光染色顯示,PCT295I突變蛋白在內質網中滯留,在高爾基體中定位減少導緻分泌減少.結論 複閤雜閤性PC基因突變(R178W和D255H、L-34P和T295I)是導緻此兩例先證者1型遺傳性PC缺陷癥的原因.R178W、D255H、L-34P是國內首次報道的PC基因突變,T295I是國際首次報道的PC基因突變,分泌障礙和細胞內降解是R178W、D255H、L-34P和T295I導緻PC缺陷癥的分子機製.
목적 대2개복합잡합적단백C(PC)기인돌변치정맥혈전적가계진행림상표형、기인형화분자발병궤제적연구.방법 대혈장단백C활성(PC:A)화항원(PC:Ag)분별용발색저물법화ELISA법진행측정,이응혈매생성시험검측환자응혈공능적변화.PCR법확증선증자PC기인적9개외현자급기측익서렬,PCR산물순화후직접측서,검측기기인돌변.RT-PCR법결합정점돌변법구건PC기인야생형화돌변형표체질립(PC wt、PC R178W、PC D255H、PC L-34P、PC T295I),순시전염COS-7세포,검측세포내、외PC:Ag적함량.이용세포면역형광염색관찰내질망화고이기체중PC단백적정위.결과 선증자1,28세청년남성,림상진단위하지심정맥혈전화폐전새,PC:A 21%,PC:Ag 18.36%,위I형단백C결함증,기인분석현시재기PC기인7호화9호외현자분별존재R178W화D255H적복합잡합돌변,기중D255H래자기부친;선증자2,남,16세,PC:A 21%,PC:Ag 20.04%,Ⅰ형PC결함증,재기PC기인적2호화9호외현자분별존재L-34P화T295I적복합잡합돌변,기중L-34P래자기모친,T295I래자기부친.응혈매생성시험현시기부모적항응공능감약,응혈매조절단백(TM)억제응혈매생성적능력강저.체외표체연구현시,PCL-34P지유7%분비지세포외,세포내PC:Ag야지유8.72%,설명존재엄중적분비장애화세포내강해가속현상;PCR178W지유겁소량(8%)종세포내분비,이PCD255H화PCT295I분별유57%화34%분비지세포외,세포내PC:Ag함량분별시44.38%、38.05%화61.57%.세포면역형광염색현시,PCT295I돌변단백재내질망중체류,재고이기체중정위감소도치분비감소.결론 복합잡합성PC기인돌변(R178W화D255H、L-34P화T295I)시도치차량례선증자1형유전성PC결함증적원인.R178W、D255H、L-34P시국내수차보도적PC기인돌변,T295I시국제수차보도적PC기인돌변,분비장애화세포내강해시R178W、D255H、L-34P화T295I도치PC결함증적분자궤제.
