CAJ | 학술논문

死亡素是由21个氨基酸残基组成的广谱抗菌肽.为了高效表达可溶性的死亡素,本研究利用递归式PCR(recursive PCR,rPCR)扩增了死亡素基因thanatin,并将其和家蝇Musca domestica泛素基因ubiquitin构成嵌合基因,克隆到表达载体pET-32a,再与硫氧还蛋白融合后构建表达载体pET-TRX-UBI-THA.将酶切和测序鉴定正确的质粒转化表达宿主菌BL21,经0.6 mmol/L IPTG诱导,TRX-UBI-THA融合蛋白得到了高效可溶性表达.SDS-PAGE和Western blot检测结果表明融合蛋白的分子量为28.9 kD,与预期的结果一致,表达量占菌体总蛋白的46%.Western blot分析结果显示融合蛋白能与Ni-NTA鏊合物特异性的结合,表明在融合蛋白的N-端带有6×His标签.利用C-端带有6×His标签的泛素C-端水解酶对融合蛋白进行切割,切割产物经Ni2+-NTA亲和柱和HPLC纯化(纯化量为5.4 mg/L),Tricince-SDS-PAGE电泳得到单一的泛素蛋白条带.电喷雾质谱(ESI-MS)分析表明,纯化的泛素分子量为2.57 kD,与通过氨基酸预测的分子量完全一致.利用琼脂孔穴扩散法对泛素活性进行检测,结果显示纯化的泛素对大肠杆菌K12D31和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus具有较强的活性抑制.本研究表明,利用泛素融合技术可以高效表达可溶性的死亡素.
사망소시유21개안기산잔기조성적엄보항균태.위료고효표체가용성적사망소,본연구이용체귀식PCR(recursive PCR,rPCR)확증료사망소기인thanatin,병장기화가승Musca domestica범소기인ubiquitin구성감합기인,극륭도표체재체pET-32a,재여류양환단백융합후구건표체재체pET-TRX-UBI-THA.장매절화측서감정정학적질립전화표체숙주균BL21,경0.6 mmol/L IPTG유도,TRX-UBI-THA융합단백득도료고효가용성표체.SDS-PAGE화Western blot검측결과표명융합단백적분자량위28.9 kD,여예기적결과일치,표체량점균체총단백적46%.Western blot분석결과현시융합단백능여Ni-NTA오합물특이성적결합,표명재융합단백적N-단대유6×His표첨.이용C-단대유6×His표첨적범소C-단수해매대융합단백진행절할,절할산물경Ni2+-NTA친화주화HPLC순화(순화량위5.4 mg/L),Tricince-SDS-PAGE전영득도단일적범소단백조대.전분무질보(ESI-MS)분석표명,순화적범소분자량위2.57 kD,여통과안기산예측적분자량완전일치.이용경지공혈확산법대범소활성진행검측,결과현시순화적범소대대장간균K12D31화금황색포도구균Staphylococcus aureus구유교강적활성억제.본연구표명,이용범소융합기술가이고효표체가용성적사망소.