华中科技大学学报（医学版）
華中科技大學學報（醫學版）
화중과기대학학보（의학판）
ACTA UNIVERSITATIS MEDICINAE TONGJI
2011年
2期
142-146
,共5页
汪理%勾善淼%周伟%王统林%刘涛%王春友
汪理%勾善淼%週偉%王統林%劉濤%王春友
왕리%구선묘%주위%왕통림%류도%왕춘우
胰腺癌%糖原合成激酶-3β%转染%RNA干扰%短发夹状RNA
胰腺癌%糖原閤成激酶-3β%轉染%RNA榦擾%短髮夾狀RNA
이선암%당원합성격매-3β%전염%RNA간우%단발협상RNA
目的 构建针对人糖原合成激酶-3β(GSK-3β)基因的shRNA真核表达质粒,并筛选基因沉默效果最明显的shRNA质粒表达载体;转染人胰腺癌细胞株PANC-1,建立稳定表达GSK-3β shRNA的细胞模型.方法 针对GSK-3β基因的mRNA序列设计并分别构建3个shRNA质粒表达载体和1个阴性对照质粒表达载体,经大肠埃希菌扩增,酶切、PCR、测序鉴定,转染胰腺癌PANC-1细胞,采用Real-time PCR检测GSK-3β mRNA被抑制情况.选取抑制效应最强的重组质粒和阴性质粒转染的PANC-1细胞,经G418筛选后,建立稳定表达GSK-3β-shRNA的PANC-1细胞株(实验组)和稳定表达control-shRNA的PANC-1细胞株(阴性对照组).分别采用荧光显微镜和流式细胞术观察细胞的转染情况;Real-time PCR和Western blot分析GSK-3β的表达.结果 ①经测序证实,成功构建GSK-3β-shRNA真核表达质粒,插入的DNA片段的序列与设计序列完全一致;②重组质粒瞬时转染PANC-1细胞后,GSK-3β mRNA明显下调(P＜0.05),其中以2号重组质粒效应最强;③重组质粒稳定转染后检测PANC-1细胞中GSK-3β的表达,Real-time PCR和Western blot结果均提示:与未转染的阴性对照组和载体对照组比较,实验组中GSK-3β mRNA和蛋白的表达均显著降低(均P＜0.05).结论 成功构建了携带以GSK-3β为靶向的shRNA的重组质粒.经脂质体途径稳定转染PANC-1细胞,该shRNA能够显著抑制GSK-3β的表达.
目的 構建針對人糖原閤成激酶-3β(GSK-3β)基因的shRNA真覈錶達質粒,併篩選基因沉默效果最明顯的shRNA質粒錶達載體;轉染人胰腺癌細胞株PANC-1,建立穩定錶達GSK-3β shRNA的細胞模型.方法 針對GSK-3β基因的mRNA序列設計併分彆構建3箇shRNA質粒錶達載體和1箇陰性對照質粒錶達載體,經大腸埃希菌擴增,酶切、PCR、測序鑒定,轉染胰腺癌PANC-1細胞,採用Real-time PCR檢測GSK-3β mRNA被抑製情況.選取抑製效應最彊的重組質粒和陰性質粒轉染的PANC-1細胞,經G418篩選後,建立穩定錶達GSK-3β-shRNA的PANC-1細胞株(實驗組)和穩定錶達control-shRNA的PANC-1細胞株(陰性對照組).分彆採用熒光顯微鏡和流式細胞術觀察細胞的轉染情況;Real-time PCR和Western blot分析GSK-3β的錶達.結果 ①經測序證實,成功構建GSK-3β-shRNA真覈錶達質粒,插入的DNA片段的序列與設計序列完全一緻;②重組質粒瞬時轉染PANC-1細胞後,GSK-3β mRNA明顯下調(P＜0.05),其中以2號重組質粒效應最彊;③重組質粒穩定轉染後檢測PANC-1細胞中GSK-3β的錶達,Real-time PCR和Western blot結果均提示:與未轉染的陰性對照組和載體對照組比較,實驗組中GSK-3β mRNA和蛋白的錶達均顯著降低(均P＜0.05).結論 成功構建瞭攜帶以GSK-3β為靶嚮的shRNA的重組質粒.經脂質體途徑穩定轉染PANC-1細胞,該shRNA能夠顯著抑製GSK-3β的錶達.
목적 구건침대인당원합성격매-3β(GSK-3β)기인적shRNA진핵표체질립,병사선기인침묵효과최명현적shRNA질립표체재체;전염인이선암세포주PANC-1,건립은정표체GSK-3β shRNA적세포모형.방법 침대GSK-3β기인적mRNA서렬설계병분별구건3개shRNA질립표체재체화1개음성대조질립표체재체,경대장애희균확증,매절、PCR、측서감정,전염이선암PANC-1세포,채용Real-time PCR검측GSK-3β mRNA피억제정황.선취억제효응최강적중조질립화음성질립전염적PANC-1세포,경G418사선후,건립은정표체GSK-3β-shRNA적PANC-1세포주(실험조)화은정표체control-shRNA적PANC-1세포주(음성대조조).분별채용형광현미경화류식세포술관찰세포적전염정황;Real-time PCR화Western blot분석GSK-3β적표체.결과 ①경측서증실,성공구건GSK-3β-shRNA진핵표체질립,삽입적DNA편단적서렬여설계서렬완전일치;②중조질립순시전염PANC-1세포후,GSK-3β mRNA명현하조(P＜0.05),기중이2호중조질립효응최강;③중조질립은정전염후검측PANC-1세포중GSK-3β적표체,Real-time PCR화Western blot결과균제시:여미전염적음성대조조화재체대조조비교,실험조중GSK-3β mRNA화단백적표체균현저강저(균P＜0.05).결론 성공구건료휴대이GSK-3β위파향적shRNA적중조질립.경지질체도경은정전염PANC-1세포,해shRNA능구현저억제GSK-3β적표체.
