浙江大学学报(医学版)
浙江大學學報(醫學版)
절강대학학보(의학판)
JOURNAL OF ZHEJIANG UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCES)
2009年
2期
136-144
,共9页
刘容%马文江%周建娅%杨光迪%周建英
劉容%馬文江%週建婭%楊光迪%週建英
류용%마문강%주건아%양광적%주건영
RNA%小分子干扰%肿瘤/治疗%血管内皮细胞生长因子%移植肿瘤%鸡胚尿囊膜试验%新生血管%基因治疗
RNA%小分子榦擾%腫瘤/治療%血管內皮細胞生長因子%移植腫瘤%鷄胚尿囊膜試驗%新生血管%基因治療
RNA%소분자간우%종류/치료%혈관내피세포생장인자%이식종류%계배뇨낭막시험%신생혈관%기인치료
目的:探讨血管内皮细胞生长因子(human vascular endothelial growth factor,hVEGF)的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)对A549细胞裸鼠移植肿瘤生长以及对鸡胚尿囊膜(chorioallantoic membrane,CAM)上诱导新生血管的影响.方法:分别构建3个表达不同特异性hVEGF siRNA序列的质粒载体,与表达无关序列siRNA质粒载体分别转染A549细胞,用ELISA与realtime RT-PCR选出抑制hVEGF效果最佳的hVEGF siRNA质粒.G418筛选出稳定表达抑制效果最佳的hVEGF siRNA和表达无关序列siRNA的A549细胞,与未转染的A549细胞分别注射于裸鼠皮下,观察3组细胞在裸鼠皮下成瘤及肿瘤生长的速度.鸡胚尿囊实验:孵育至第9天的白皮受精种蛋随机分为4组,分别在鸡胚尿囊膜表面加未培养过A549细胞的DMEM培养液(阴性对照组),未转染的A549细胞培养上清液(阳性对照组),转染hVEGF siRNA的A549细胞培养上清液(hVEGF siRNA组),转染无关序列siRNA的A549细胞培养上清液(无关序列siRNA组),继续孵育48 h,取固定后的鸡胚绒毛尿囊膜于显微镜下计数血管分支点和血管分支长度.结果:hVEGF siRNA使A549细胞表达mRNA水平最大下降70%,分泌hVEGF水平最大下降48%.在裸鼠移植瘤模型中,hVEGF siRNA组比无关序列siRNA组肿瘤平均体积减少58%,肿瘤生长到50 mm3的平均时间延迟5.4 d,移植肿瘤组织匀浆hVEGF含量降低54%;而肿瘤的倍增时间与肿瘤生长速率差异不显著.在鸡胚尿囊膜实验中,阴性对照组加样液的hVEGF含量为0,hVEGF siRNA组加样液的hVEGF含量约占无关序列siRNA组和阳性对照组的40%～44%;血管分支点计数,hVEGF siRNA组,无关序列siRNA组与阳性对照组比阴性对照组增加45%～55%;血管分支总长度hVEGF siRNA组比阴性对照组增加约53%,无关序列siRNA组和阳性对照组比阴性对照组分别增加约97%及99%.CAM血管图上与阴性对照组比较VEGF siRNA组可见增多的血管分支,阳性对照组和无关序列siRNA组上还可以见血管分支增粗、增长.结论:构建并证实质粒介导的hVEGF siRNA能抑制A549细胞分泌VEGF,从而抑制A549细胞诱导鸡胚尿囊膜的血管新生.在裸鼠移植瘤模型中,hVEGF siRNA能抑制肿瘤早期生长,对肿瘤后期的生长速率无显著抑制.
目的:探討血管內皮細胞生長因子(human vascular endothelial growth factor,hVEGF)的小榦擾RNA(small interfering RNA,siRNA)對A549細胞裸鼠移植腫瘤生長以及對鷄胚尿囊膜(chorioallantoic membrane,CAM)上誘導新生血管的影響.方法:分彆構建3箇錶達不同特異性hVEGF siRNA序列的質粒載體,與錶達無關序列siRNA質粒載體分彆轉染A549細胞,用ELISA與realtime RT-PCR選齣抑製hVEGF效果最佳的hVEGF siRNA質粒.G418篩選齣穩定錶達抑製效果最佳的hVEGF siRNA和錶達無關序列siRNA的A549細胞,與未轉染的A549細胞分彆註射于裸鼠皮下,觀察3組細胞在裸鼠皮下成瘤及腫瘤生長的速度.鷄胚尿囊實驗:孵育至第9天的白皮受精種蛋隨機分為4組,分彆在鷄胚尿囊膜錶麵加未培養過A549細胞的DMEM培養液(陰性對照組),未轉染的A549細胞培養上清液(暘性對照組),轉染hVEGF siRNA的A549細胞培養上清液(hVEGF siRNA組),轉染無關序列siRNA的A549細胞培養上清液(無關序列siRNA組),繼續孵育48 h,取固定後的鷄胚絨毛尿囊膜于顯微鏡下計數血管分支點和血管分支長度.結果:hVEGF siRNA使A549細胞錶達mRNA水平最大下降70%,分泌hVEGF水平最大下降48%.在裸鼠移植瘤模型中,hVEGF siRNA組比無關序列siRNA組腫瘤平均體積減少58%,腫瘤生長到50 mm3的平均時間延遲5.4 d,移植腫瘤組織勻漿hVEGF含量降低54%;而腫瘤的倍增時間與腫瘤生長速率差異不顯著.在鷄胚尿囊膜實驗中,陰性對照組加樣液的hVEGF含量為0,hVEGF siRNA組加樣液的hVEGF含量約佔無關序列siRNA組和暘性對照組的40%～44%;血管分支點計數,hVEGF siRNA組,無關序列siRNA組與暘性對照組比陰性對照組增加45%～55%;血管分支總長度hVEGF siRNA組比陰性對照組增加約53%,無關序列siRNA組和暘性對照組比陰性對照組分彆增加約97%及99%.CAM血管圖上與陰性對照組比較VEGF siRNA組可見增多的血管分支,暘性對照組和無關序列siRNA組上還可以見血管分支增粗、增長.結論:構建併證實質粒介導的hVEGF siRNA能抑製A549細胞分泌VEGF,從而抑製A549細胞誘導鷄胚尿囊膜的血管新生.在裸鼠移植瘤模型中,hVEGF siRNA能抑製腫瘤早期生長,對腫瘤後期的生長速率無顯著抑製.
목적:탐토혈관내피세포생장인자(human vascular endothelial growth factor,hVEGF)적소간우RNA(small interfering RNA,siRNA)대A549세포라서이식종류생장이급대계배뇨낭막(chorioallantoic membrane,CAM)상유도신생혈관적영향.방법:분별구건3개표체불동특이성hVEGF siRNA서렬적질립재체,여표체무관서렬siRNA질립재체분별전염A549세포,용ELISA여realtime RT-PCR선출억제hVEGF효과최가적hVEGF siRNA질립.G418사선출은정표체억제효과최가적hVEGF siRNA화표체무관서렬siRNA적A549세포,여미전염적A549세포분별주사우라서피하,관찰3조세포재라서피하성류급종류생장적속도.계배뇨낭실험:부육지제9천적백피수정충단수궤분위4조,분별재계배뇨낭막표면가미배양과A549세포적DMEM배양액(음성대조조),미전염적A549세포배양상청액(양성대조조),전염hVEGF siRNA적A549세포배양상청액(hVEGF siRNA조),전염무관서렬siRNA적A549세포배양상청액(무관서렬siRNA조),계속부육48 h,취고정후적계배융모뇨낭막우현미경하계수혈관분지점화혈관분지장도.결과:hVEGF siRNA사A549세포표체mRNA수평최대하강70%,분비hVEGF수평최대하강48%.재라서이식류모형중,hVEGF siRNA조비무관서렬siRNA조종류평균체적감소58%,종류생장도50 mm3적평균시간연지5.4 d,이식종류조직균장hVEGF함량강저54%;이종류적배증시간여종류생장속솔차이불현저.재계배뇨낭막실험중,음성대조조가양액적hVEGF함량위0,hVEGF siRNA조가양액적hVEGF함량약점무관서렬siRNA조화양성대조조적40%～44%;혈관분지점계수,hVEGF siRNA조,무관서렬siRNA조여양성대조조비음성대조조증가45%～55%;혈관분지총장도hVEGF siRNA조비음성대조조증가약53%,무관서렬siRNA조화양성대조조비음성대조조분별증가약97%급99%.CAM혈관도상여음성대조조비교VEGF siRNA조가견증다적혈관분지,양성대조조화무관서렬siRNA조상환가이견혈관분지증조、증장.결론:구건병증실질립개도적hVEGF siRNA능억제A549세포분비VEGF,종이억제A549세포유도계배뇨낭막적혈관신생.재라서이식류모형중,hVEGF siRNA능억제종류조기생장,대종류후기적생장속솔무현저억제.
