生物技术通报
生物技術通報
생물기술통보
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
2012年
4期
135-140
,共6页
DN-AMPK%腺病毒%C2C12%肌管分化
DN-AMPK%腺病毒%C2C12%肌管分化
DN-AMPK%선병독%C2C12%기관분화
在研究AMPK的调控网络时,通常利用过表达显性失活突变型AMPK(dominant negative AMPK,DN-AMPK)作为研究手段来验证AMPK在某些重要生理病理调节通路中的关键作用.旨在利用Ad5腺病毒载体体系构建Ad-DN-AMPK表达载体,并在成肌细胞系C2C12中检测无活性AMPK高表达后对C2C12细胞分化为肌管细胞的影响.通过构建AMPKα1(D159A)和AMPKα2(K45R)的腺病毒表达载体,在HEK293细胞中成功包装并扩增出完整的腺病毒,待其感染能力基本稳定后,将腺病毒感染C2C12,利用激光定量成像仪检测其感染滴度,感染效率能高达100％,并且能够持续表达6d.DN-AMPK高表达后,AMPK常用激活剂A769662(SN-5)不能激活AMPK,表现为AMPK下游蛋白活性丧失,如ACC磷酸化无变化.通过实时定量PCR的方法,检测DN-AMPK对C2C12分化为肌管细胞的影响,结果表明过表达DN-AMPK能够促进C2C12细胞分化为肌管细胞的标记蛋白(Myod 和Myogenin)的表达,即促进C2C12分化为肌管细胞.
在研究AMPK的調控網絡時,通常利用過錶達顯性失活突變型AMPK(dominant negative AMPK,DN-AMPK)作為研究手段來驗證AMPK在某些重要生理病理調節通路中的關鍵作用.旨在利用Ad5腺病毒載體體繫構建Ad-DN-AMPK錶達載體,併在成肌細胞繫C2C12中檢測無活性AMPK高錶達後對C2C12細胞分化為肌管細胞的影響.通過構建AMPKα1(D159A)和AMPKα2(K45R)的腺病毒錶達載體,在HEK293細胞中成功包裝併擴增齣完整的腺病毒,待其感染能力基本穩定後,將腺病毒感染C2C12,利用激光定量成像儀檢測其感染滴度,感染效率能高達100％,併且能夠持續錶達6d.DN-AMPK高錶達後,AMPK常用激活劑A769662(SN-5)不能激活AMPK,錶現為AMPK下遊蛋白活性喪失,如ACC燐痠化無變化.通過實時定量PCR的方法,檢測DN-AMPK對C2C12分化為肌管細胞的影響,結果錶明過錶達DN-AMPK能夠促進C2C12細胞分化為肌管細胞的標記蛋白(Myod 和Myogenin)的錶達,即促進C2C12分化為肌管細胞.
재연구AMPK적조공망락시,통상이용과표체현성실활돌변형AMPK(dominant negative AMPK,DN-AMPK)작위연구수단래험증AMPK재모사중요생리병리조절통로중적관건작용.지재이용Ad5선병독재체체계구건Ad-DN-AMPK표체재체,병재성기세포계C2C12중검측무활성AMPK고표체후대C2C12세포분화위기관세포적영향.통과구건AMPKα1(D159A)화AMPKα2(K45R)적선병독표체재체,재HEK293세포중성공포장병확증출완정적선병독,대기감염능력기본은정후,장선병독감염C2C12,이용격광정량성상의검측기감염적도,감염효솔능고체100％,병차능구지속표체6d.DN-AMPK고표체후,AMPK상용격활제A769662(SN-5)불능격활AMPK,표현위AMPK하유단백활성상실,여ACC린산화무변화.통과실시정량PCR적방법,검측DN-AMPK대C2C12분화위기관세포적영향,결과표명과표체DN-AMPK능구촉진C2C12세포분화위기관세포적표기단백(Myod 화Myogenin)적표체,즉촉진C2C12분화위기관세포.
