细胞与分子免疫学杂志
細胞與分子免疫學雜誌
세포여분자면역학잡지
2007年
12期
1147-1149,1156
,共4页
陈小军%王洋%屈浩%葛新顺%左玉丰%廖晓龙
陳小軍%王洋%屈浩%葛新順%左玉豐%廖曉龍
진소군%왕양%굴호%갈신순%좌옥봉%료효룡
CD33%scFv%原核表达%复性
CD33%scFv%原覈錶達%複性
CD33%scFv%원핵표체%복성
目的:构建及表达抗人CD33单链抗体(抗CD33-scFv)基因,并检测其生物活性.方法:采用RT-PCR方法从分泌抗人类白细胞表面分化抗原CD33单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞中克隆出VL和VH可变区基因,再通过重叠延伸拼接(splice-overlap extension)PCR方法在VH和VL可变区基因之间引入柔性连接肽(Gly4Ser)3,体外构建抗人CD33-scFv基因.将其克隆至原核表达载体PET-28a(+)并在大肠杆菌Rosetta(DE3)中表达.结果:SDS-PAGE和Westem blot分析结果表明,抗CD33-scFv在Rosetta(DE3)菌中获得高效表达,重组蛋白的相对分子质量(Mr)为30000,表达产物以不溶性包涵体形式存在,经过溶解包涵体,镍柱亲和层析纯化和体外复性过程,获得了高纯度的scFv片段.流式细胞术(FCM)分析结果证实抗CD33-scFv可与人类白细胞表面的分化抗原CD33结合,保留了鼠源性mAb的与CD33结合的活性.结论:重组抗人CD33-scFv基因构建与表达成功,并且通过复性得到有生物活性的scFv,为下一步针对髓系恶性肿瘤的靶向治疗奠定了基础.
目的:構建及錶達抗人CD33單鏈抗體(抗CD33-scFv)基因,併檢測其生物活性.方法:採用RT-PCR方法從分泌抗人類白細胞錶麵分化抗原CD33單剋隆抗體(mAb)的雜交瘤細胞中剋隆齣VL和VH可變區基因,再通過重疊延伸拼接(splice-overlap extension)PCR方法在VH和VL可變區基因之間引入柔性連接肽(Gly4Ser)3,體外構建抗人CD33-scFv基因.將其剋隆至原覈錶達載體PET-28a(+)併在大腸桿菌Rosetta(DE3)中錶達.結果:SDS-PAGE和Westem blot分析結果錶明,抗CD33-scFv在Rosetta(DE3)菌中穫得高效錶達,重組蛋白的相對分子質量(Mr)為30000,錶達產物以不溶性包涵體形式存在,經過溶解包涵體,鎳柱親和層析純化和體外複性過程,穫得瞭高純度的scFv片段.流式細胞術(FCM)分析結果證實抗CD33-scFv可與人類白細胞錶麵的分化抗原CD33結閤,保留瞭鼠源性mAb的與CD33結閤的活性.結論:重組抗人CD33-scFv基因構建與錶達成功,併且通過複性得到有生物活性的scFv,為下一步針對髓繫噁性腫瘤的靶嚮治療奠定瞭基礎.
목적:구건급표체항인CD33단련항체(항CD33-scFv)기인,병검측기생물활성.방법:채용RT-PCR방법종분비항인류백세포표면분화항원CD33단극륭항체(mAb)적잡교류세포중극륭출VL화VH가변구기인,재통과중첩연신병접(splice-overlap extension)PCR방법재VH화VL가변구기인지간인입유성련접태(Gly4Ser)3,체외구건항인CD33-scFv기인.장기극륭지원핵표체재체PET-28a(+)병재대장간균Rosetta(DE3)중표체.결과:SDS-PAGE화Westem blot분석결과표명,항CD33-scFv재Rosetta(DE3)균중획득고효표체,중조단백적상대분자질량(Mr)위30000,표체산물이불용성포함체형식존재,경과용해포함체,얼주친화층석순화화체외복성과정,획득료고순도적scFv편단.류식세포술(FCM)분석결과증실항CD33-scFv가여인류백세포표면적분화항원CD33결합,보류료서원성mAb적여CD33결합적활성.결론:중조항인CD33-scFv기인구건여표체성공,병차통과복성득도유생물활성적scFv,위하일보침대수계악성종류적파향치료전정료기출.
