CAJ | 학술논문

目的:观察转染癌基因的骨髓基质干细胞在体外分化情况,为肝细胞癌的细胞源研究提供实验依据.方法:实验于2003-05/2004-06在南方医科大学药理教研室实验室完成.①两步法获取大鼠肝细胞,梯度离心法分离大鼠骨髓基质干细胞.②单基因转染是单独将c-myc或K-ras癌基因瞬时转染大鼠骨髓基质干细胞,6孔培养板中培养,24 h后荧光显微镜下观察骨髓基质干细胞转染结果.双基因转染步骤相同,只是将c-myc和K-ras癌基因同时转染大鼠骨髓基质干细胞.③c-myc癌基因转染组、K-ras癌基因转染组、双癌基因转染组常规培养,加入含体积分数为0.1胎牛血清的DMEM培养基,于37℃、体积分数为0.05的CO2孵箱培养,每24 h半量更换培养液.④c-myc癌基因转染+肝细胞组、K-ras癌基因转染+肝细胞组、双癌基因转染+肝细胞组将已转染癌基因的骨髓基质干细胞,置于叠加的培养板半透膜的上方(细胞密度均为1×105个/cm2),再将肝细胞置于半透膜的下方(每孔细胞密度为3×105/cm2)进行共培养,其余步骤同常规培养.⑤通过反转录聚合酶式反应和细胞免疫组化检测骨髓基质干细胞分化情况.结果:①癌基因转染24 h骨髓基质干细胞检测结果:单独转染c-myc或K-ras癌基因的细胞,其绿色荧光蛋白呈均匀一致分布;双基因转染的细胞,绿色荧光蛋白呈点片状分布.②各组骨髓基质干细胞向肿瘤细胞分化检测结果:c-myc癌基因转染组、K-ras癌基因转染组、双癌基因转染组的骨髓基质干细胞,均未向肿瘤细胞分化;c-myc癌基因转染+肝细胞组、K-ras癌基因转染+肝细胞组、双癌基因转染+肝细胞组的骨髓基质干细胞,均向肝细胞癌发展;空白对照组骨髓基质干细胞细胞均为阴性.此外,双癌基因转染+肝细胞组的骨髓基质干细胞分化增殖迅速,反转录聚合酶式反应和免疫组化检测发现,培养第7天出现甲胎蛋白表达,并迅速增加,而第7天出现的白蛋白和细胞角蛋白18表达迅速减弱,第14天消失.结论:转染癌基因的骨髓基质干细胞,在向肝细胞诱导的条件下,部分癌基因可以使干细胞分化为肝癌细胞;多癌基因转染时,更易于使干细胞分化为肝癌细胞. 目的:觀察轉染癌基因的骨髓基質榦細胞在體外分化情況,為肝細胞癌的細胞源研究提供實驗依據.方法:實驗于2003-05/2004-06在南方醫科大學藥理教研室實驗室完成.①兩步法穫取大鼠肝細胞,梯度離心法分離大鼠骨髓基質榦細胞.②單基因轉染是單獨將c-myc或K-ras癌基因瞬時轉染大鼠骨髓基質榦細胞,6孔培養闆中培養,24 h後熒光顯微鏡下觀察骨髓基質榦細胞轉染結果.雙基因轉染步驟相同,隻是將c-myc和K-ras癌基因同時轉染大鼠骨髓基質榦細胞.③c-myc癌基因轉染組、K-ras癌基因轉染組、雙癌基因轉染組常規培養,加入含體積分數為0.1胎牛血清的DMEM培養基,于37℃、體積分數為0.05的CO2孵箱培養,每24 h半量更換培養液.④c-myc癌基因轉染+肝細胞組、K-ras癌基因轉染+肝細胞組、雙癌基因轉染+肝細胞組將已轉染癌基因的骨髓基質榦細胞,置于疊加的培養闆半透膜的上方(細胞密度均為1×105箇/cm2),再將肝細胞置于半透膜的下方(每孔細胞密度為3×105/cm2)進行共培養,其餘步驟同常規培養.⑤通過反轉錄聚閤酶式反應和細胞免疫組化檢測骨髓基質榦細胞分化情況.結果:①癌基因轉染24 h骨髓基質榦細胞檢測結果:單獨轉染c-myc或K-ras癌基因的細胞,其綠色熒光蛋白呈均勻一緻分佈;雙基因轉染的細胞,綠色熒光蛋白呈點片狀分佈.②各組骨髓基質榦細胞嚮腫瘤細胞分化檢測結果:c-myc癌基因轉染組、K-ras癌基因轉染組、雙癌基因轉染組的骨髓基質榦細胞,均未嚮腫瘤細胞分化;c-myc癌基因轉染+肝細胞組、K-ras癌基因轉染+肝細胞組、雙癌基因轉染+肝細胞組的骨髓基質榦細胞,均嚮肝細胞癌髮展;空白對照組骨髓基質榦細胞細胞均為陰性.此外,雙癌基因轉染+肝細胞組的骨髓基質榦細胞分化增殖迅速,反轉錄聚閤酶式反應和免疫組化檢測髮現,培養第7天齣現甲胎蛋白錶達,併迅速增加,而第7天齣現的白蛋白和細胞角蛋白18錶達迅速減弱,第14天消失.結論:轉染癌基因的骨髓基質榦細胞,在嚮肝細胞誘導的條件下,部分癌基因可以使榦細胞分化為肝癌細胞;多癌基因轉染時,更易于使榦細胞分化為肝癌細胞.
목적:관찰전염암기인적골수기질간세포재체외분화정황,위간세포암적세포원연구제공실험의거.방법:실험우2003-05/2004-06재남방의과대학약리교연실실험실완성.①량보법획취대서간세포,제도리심법분리대서골수기질간세포.②단기인전염시단독장c-myc혹K-ras암기인순시전염대서골수기질간세포,6공배양판중배양,24 h후형광현미경하관찰골수기질간세포전염결과.쌍기인전염보취상동,지시장c-myc화K-ras암기인동시전염대서골수기질간세포.③c-myc암기인전염조、K-ras암기인전염조、쌍암기인전염조상규배양,가입함체적분수위0.1태우혈청적DMEM배양기,우37℃、체적분수위0.05적CO2부상배양,매24 h반량경환배양액.④c-myc암기인전염+간세포조、K-ras암기인전염+간세포조、쌍암기인전염+간세포조장이전염암기인적골수기질간세포,치우첩가적배양판반투막적상방(세포밀도균위1×105개/cm2),재장간세포치우반투막적하방(매공세포밀도위3×105/cm2)진행공배양,기여보취동상규배양.⑤통과반전록취합매식반응화세포면역조화검측골수기질간세포분화정황.결과:①암기인전염24 h골수기질간세포검측결과:단독전염c-myc혹K-ras암기인적세포,기록색형광단백정균균일치분포;쌍기인전염적세포,록색형광단백정점편상분포.②각조골수기질간세포향종류세포분화검측결과:c-myc암기인전염조、K-ras암기인전염조、쌍암기인전염조적골수기질간세포,균미향종류세포분화;c-myc암기인전염+간세포조、K-ras암기인전염+간세포조、쌍암기인전염+간세포조적골수기질간세포,균향간세포암발전;공백대조조골수기질간세포세포균위음성.차외,쌍암기인전염+간세포조적골수기질간세포분화증식신속,반전록취합매식반응화면역조화검측발현,배양제7천출현갑태단백표체,병신속증가,이제7천출현적백단백화세포각단백18표체신속감약,제14천소실.결론:전염암기인적골수기질간세포,재향간세포유도적조건하,부분암기인가이사간세포분화위간암세포;다암기인전염시,경역우사간세포분화위간암세포.