CAJ | 학술논문

目的:利用干细胞分化获得胰岛细胞后目前还没有较理想的鉴别方法,实验通过单细胞反转录酶聚合链式反应技术鉴别胰岛干细胞标记物胰岛素促进因子,以建立一种检测胰岛干细胞的有效方法.方法:实验于2001-10/2005-08在加拿大多伦多大学和南京大学附属鼓楼医院完成.①将收集培养2～4周的单个胰岛干细胞用于实验.②胰岛活性测定实验中,选择1×106分化的胰腺干细胞,用低浓度和高浓度葡萄糖分别刺激1～4 h,检测12,14,24 d培养液中胰岛素的浓度.③单细胞反转录酶聚合链式反应检测胰岛素促进因子基因实验中,选择12个单个胰腺干细胞进行检测,另取12个单个未分化的干细胞作为对照.聚合链式反应体系为20μL.聚合链式反应扩增反应条件为94℃预变性4 min,94℃变性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸2 min条件下循环35次.聚合链式反应产物以质量浓度为20g/L的琼脂糖凝胶电泳.结果:①分化的胰腺干细胞培养液中胰岛素浓度的检测:培养12,14,24 d时培养液中胰岛素的浓度分别为42.6,68.2,73.5 IU/L,随着时间的延长,呈逐渐升高的趋势.②单个胰岛干细胞胰岛素促进因子反转录酶聚合链式反应检测结果:12个单个胰岛干细胞中有7个胰岛素促进因子表达呈阳性,而作为对照的12个未分化干细胞均未检出,两者差异显著(P＜0.001).结论:采用单细胞反转录酶聚合链式反应检测方法为胰腺干细胞的鉴定和纯化提供了技术保障,证明单细胞反转录酶聚合链式反应是一种检测胰腺干细胞标记物的有效方法.
목적:이용간세포분화획득이도세포후목전환몰유교이상적감별방법,실험통과단세포반전록매취합련식반응기술감별이도간세포표기물이도소촉진인자,이건립일충검측이도간세포적유효방법.방법:실험우2001-10/2005-08재가나대다륜다대학화남경대학부속고루의원완성.①장수집배양2～4주적단개이도간세포용우실험.②이도활성측정실험중,선택1×106분화적이선간세포,용저농도화고농도포도당분별자격1～4 h,검측12,14,24 d배양액중이도소적농도.③단세포반전록매취합련식반응검측이도소촉진인자기인실험중,선택12개단개이선간세포진행검측,령취12개단개미분화적간세포작위대조.취합련식반응체계위20μL.취합련식반응확증반응조건위94℃예변성4 min,94℃변성30 s,60℃퇴화30 s,72℃연신2 min조건하순배35차.취합련식반응산물이질량농도위20g/L적경지당응효전영.결과:①분화적이선간세포배양액중이도소농도적검측:배양12,14,24 d시배양액중이도소적농도분별위42.6,68.2,73.5 IU/L,수착시간적연장,정축점승고적추세.②단개이도간세포이도소촉진인자반전록매취합련식반응검측결과:12개단개이도간세포중유7개이도소촉진인자표체정양성,이작위대조적12개미분화간세포균미검출,량자차이현저(P＜0.001).결론:채용단세포반전록매취합련식반응검측방법위이선간세포적감정화순화제공료기술보장,증명단세포반전록매취합련식반응시일충검측이선간세포표기물적유효방법.