暨南大学学报（自然科学与医学版）
暨南大學學報（自然科學與醫學版）
기남대학학보（자연과학여의학판）
JOURNAL OF JINAN UNIVERSITY（NATURAL SCIENCE & MEDICINE EDITION）
2010年
4期
346-351
,共6页
唐小龙%江振友%庞雪云%蓝锴%欧财文
唐小龍%江振友%龐雪雲%藍鍇%歐財文
당소룡%강진우%방설운%람개%구재문
腺病毒%神经元素3(NGN3)%成对盒基因4(PAX4)%间充质干细胞(MCS)
腺病毒%神經元素3(NGN3)%成對盒基因4(PAX4)%間充質榦細胞(MCS)
선병독%신경원소3(NGN3)%성대합기인4(PAX4)%간충질간세포(MCS)
目的:运用pADxsi系统构建带人NGN3与PAX4双基因表达腺病毒载体.方法:采用基因克隆技术,将目的基因NGN3从pEGFP-N1-NGN3质粒上切下连到pShuttle-GFP-CMV上,替换GFP,得到pShuttle-CMV-NGN3;再将PAX4从pEGFP-N1-PAX4质粒上切下连到系统pShuttle-CMV-NGN3上,得到pShuttle-CMV-NGN3/CMV-PAX4穿梭质粒;最后将CMV-NGN3/CMV-PAX4从pShuttle-CMV-NGN3/CMV-PAX4转移到ADxsi骨架载体上,得到pADxsi-CMV-NGN3/CMV-PAX4病毒质粒,然后在293细胞中进行包装与扩增活性病毒,并进行病毒滴度测定.体外感染人脐带间充质干细胞.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)与免疫印迹(Western blotting)检测目的基因在细胞内的表达情况, 免疫细胞化学与间接荧光法检测目的分子在细胞内的定位.结果:酶切鉴定和PCR证明重组人NGN3与PAX4双基因表达腺病毒载体构建正确;RT-PCR与Western blotting结果显示目的基因在细胞持续稳定表达;间接荧光与免疫化学表明重组腺病毒可高效感染人脐带间充质干细胞,且目的基因特异性地定位于细胞核内.结论:应用重组技术成功构建人NGN3与PAX4双基因表达腺病毒载体,且在间充质干细胞内持续而稳定表达.
目的:運用pADxsi繫統構建帶人NGN3與PAX4雙基因錶達腺病毒載體.方法:採用基因剋隆技術,將目的基因NGN3從pEGFP-N1-NGN3質粒上切下連到pShuttle-GFP-CMV上,替換GFP,得到pShuttle-CMV-NGN3;再將PAX4從pEGFP-N1-PAX4質粒上切下連到繫統pShuttle-CMV-NGN3上,得到pShuttle-CMV-NGN3/CMV-PAX4穿梭質粒;最後將CMV-NGN3/CMV-PAX4從pShuttle-CMV-NGN3/CMV-PAX4轉移到ADxsi骨架載體上,得到pADxsi-CMV-NGN3/CMV-PAX4病毒質粒,然後在293細胞中進行包裝與擴增活性病毒,併進行病毒滴度測定.體外感染人臍帶間充質榦細胞.逆轉錄-聚閤酶鏈反應(RT-PCR)與免疫印跡(Western blotting)檢測目的基因在細胞內的錶達情況, 免疫細胞化學與間接熒光法檢測目的分子在細胞內的定位.結果:酶切鑒定和PCR證明重組人NGN3與PAX4雙基因錶達腺病毒載體構建正確;RT-PCR與Western blotting結果顯示目的基因在細胞持續穩定錶達;間接熒光與免疫化學錶明重組腺病毒可高效感染人臍帶間充質榦細胞,且目的基因特異性地定位于細胞覈內.結論:應用重組技術成功構建人NGN3與PAX4雙基因錶達腺病毒載體,且在間充質榦細胞內持續而穩定錶達.
목적:운용pADxsi계통구건대인NGN3여PAX4쌍기인표체선병독재체.방법:채용기인극륭기술,장목적기인NGN3종pEGFP-N1-NGN3질립상절하련도pShuttle-GFP-CMV상,체환GFP,득도pShuttle-CMV-NGN3;재장PAX4종pEGFP-N1-PAX4질립상절하련도계통pShuttle-CMV-NGN3상,득도pShuttle-CMV-NGN3/CMV-PAX4천사질립;최후장CMV-NGN3/CMV-PAX4종pShuttle-CMV-NGN3/CMV-PAX4전이도ADxsi골가재체상,득도pADxsi-CMV-NGN3/CMV-PAX4병독질립,연후재293세포중진행포장여확증활성병독,병진행병독적도측정.체외감염인제대간충질간세포.역전록-취합매련반응(RT-PCR)여면역인적(Western blotting)검측목적기인재세포내적표체정황, 면역세포화학여간접형광법검측목적분자재세포내적정위.결과:매절감정화PCR증명중조인NGN3여PAX4쌍기인표체선병독재체구건정학;RT-PCR여Western blotting결과현시목적기인재세포지속은정표체;간접형광여면역화학표명중조선병독가고효감염인제대간충질간세포,차목적기인특이성지정위우세포핵내.결론:응용중조기술성공구건인NGN3여PAX4쌍기인표체선병독재체,차재간충질간세포내지속이은정표체.
