CAJ | 학술논문

目的研究在非β细胞中表达成熟胰岛素,探讨替代胰岛素注射或胰岛移植治疗Ⅰ型糖尿病的方法.方法采用重叠区扩增基因拼接法(gene SOEing)自胰岛素原基因组基因中扩增胰岛素原的cDNA,并于C肽的两端引入蛋白酶furin的识别和切割位点Arg-Xaa-Lys/Arg-Arg,将获得的突变体重组表达载体pcDNA3.1/C.mINS通过脂质体法转染体外培养的Hela、293和L02细胞,转染后48、72h取细胞培养液;并将 L02细胞经G418(450mg/L)筛选2个月后,得到稳定表达胰岛素的细胞株,同时用放射免疫和免疫组织化学的方法监测细胞内外胰岛素的表达水平.结果成功地对胰岛素原cDNA的3个位点进行了突变,空载体转染的细胞无胰岛素表达,而在转染突变后胰岛素原基因cDNA的细胞培养液中胰岛素的表达量各不相同:每天8.45～188.00μIU/2.0×106Hela细胞、每天159.88～242.14μIU/2.0×106 293细胞、每天2.56～61.95μIU/2.0×106 L02细胞;免疫组织化学显示细胞浆内有囊泡状分泌颗粒.结论突变的胰岛素原cDNA能成功转染非胰岛β细胞并表达胰岛素.
목적연구재비β세포중표체성숙이도소,탐토체대이도소주사혹이도이식치료Ⅰ형당뇨병적방법.방법채용중첩구확증기인병접법(gene SOEing)자이도소원기인조기인중확증이도소원적cDNA,병우C태적량단인입단백매furin적식별화절할위점Arg-Xaa-Lys/Arg-Arg,장획득적돌변체중조표체재체pcDNA3.1/C.mINS통과지질체법전염체외배양적Hela、293화L02세포,전염후48、72h취세포배양액;병장 L02세포경G418(450mg/L)사선2개월후,득도은정표체이도소적세포주,동시용방사면역화면역조직화학적방법감측세포내외이도소적표체수평.결과성공지대이도소원cDNA적3개위점진행료돌변,공재체전염적세포무이도소표체,이재전염돌변후이도소원기인cDNA적세포배양액중이도소적표체량각불상동:매천8.45～188.00μIU/2.0×106Hela세포、매천159.88～242.14μIU/2.0×106 293세포、매천2.56～61.95μIU/2.0×106 L02세포;면역조직화학현시세포장내유낭포상분비과립.결론돌변적이도소원cDNA능성공전염비이도β세포병표체이도소.