热带医学杂志
熱帶醫學雜誌
열대의학잡지
JOURNAL OF TROPICAL MEDICINE
2003年
2期
128-132，175
,共6页
张雪雁%汤郡%杨英%马桂璋
張雪雁%湯郡%楊英%馬桂璋
장설안%탕군%양영%마계장
鼻咽癌%EB病毒%LMP1%原核表达
鼻嚥癌%EB病毒%LMP1%原覈錶達
비인암%EB병독%LMP1%원핵표체
目的构建PGEX-6P-3-CCT原核表达载体,获得大量纯化的LMP1羧基端蛋白.方法通过RT-PCR技术从B95-8细胞中扩增EBVLMP1 CCT cDNA,克隆至PGEM-T easy载体上并测序.利用引物上的BamH I与EcoRI酶切位点将CCT基因插入PGEX-6P-3,转化大肠杆菌BL21,限制性内切酶消化鉴定.IPTG诱导重组菌株表达,用SDS-PAGE与Western blot对表达产物进行鉴定,并用Sepharose 4B亲和层析柱对表达产物进行纯化,PreScissionProteas酶对融合蛋白进行解离.结果扩增的LMP1 CCT长度为597bp,测序结果与已知序列吻合.重组子经酶切鉴定,获得PGEX-6P-3-CCT原核表达菌株,Western blot表明重组蛋白能被LMP1单克隆抗体特异结合.获得约51kDa的PGEX-6P-3-CCT融合蛋白,分离纯化出约21kDa的LMP1 CCT蛋白.结论成功获得EBV LM1 CCT蛋白,为研究LMP1致瘤机制,研制生物抗癌药物奠定基础.
目的構建PGEX-6P-3-CCT原覈錶達載體,穫得大量純化的LMP1羧基耑蛋白.方法通過RT-PCR技術從B95-8細胞中擴增EBVLMP1 CCT cDNA,剋隆至PGEM-T easy載體上併測序.利用引物上的BamH I與EcoRI酶切位點將CCT基因插入PGEX-6P-3,轉化大腸桿菌BL21,限製性內切酶消化鑒定.IPTG誘導重組菌株錶達,用SDS-PAGE與Western blot對錶達產物進行鑒定,併用Sepharose 4B親和層析柱對錶達產物進行純化,PreScissionProteas酶對融閤蛋白進行解離.結果擴增的LMP1 CCT長度為597bp,測序結果與已知序列吻閤.重組子經酶切鑒定,穫得PGEX-6P-3-CCT原覈錶達菌株,Western blot錶明重組蛋白能被LMP1單剋隆抗體特異結閤.穫得約51kDa的PGEX-6P-3-CCT融閤蛋白,分離純化齣約21kDa的LMP1 CCT蛋白.結論成功穫得EBV LM1 CCT蛋白,為研究LMP1緻瘤機製,研製生物抗癌藥物奠定基礎.
목적구건PGEX-6P-3-CCT원핵표체재체,획득대량순화적LMP1최기단단백.방법통과RT-PCR기술종B95-8세포중확증EBVLMP1 CCT cDNA,극륭지PGEM-T easy재체상병측서.이용인물상적BamH I여EcoRI매절위점장CCT기인삽입PGEX-6P-3,전화대장간균BL21,한제성내절매소화감정.IPTG유도중조균주표체,용SDS-PAGE여Western blot대표체산물진행감정,병용Sepharose 4B친화층석주대표체산물진행순화,PreScissionProteas매대융합단백진행해리.결과확증적LMP1 CCT장도위597bp,측서결과여이지서렬문합.중조자경매절감정,획득PGEX-6P-3-CCT원핵표체균주,Western blot표명중조단백능피LMP1단극륭항체특이결합.획득약51kDa적PGEX-6P-3-CCT융합단백,분리순화출약21kDa적LMP1 CCT단백.결론성공획득EBV LM1 CCT단백,위연구LMP1치류궤제,연제생물항암약물전정기출.
