军事医学
軍事醫學
군사의학
BULLETIN OF THE ACADEMY OF MILITARY MEDICAL SCIENCES
2012年
11期
843-846
,共4页
高新%宋海峰%林殿海%杨小盼%万德友%陈枢青
高新%宋海峰%林殿海%楊小盼%萬德友%陳樞青
고신%송해봉%림전해%양소반%만덕우%진추청
肿瘤坏死因子受体%毕赤酵母%糖基工程化过程%发酵%纯化%生物活性
腫瘤壞死因子受體%畢赤酵母%糖基工程化過程%髮酵%純化%生物活性
종류배사인자수체%필적효모%당기공정화과정%발효%순화%생물활성
目的 在糖基工程化毕赤酵母中表达人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-免疫球蛋白G1 Fc融合蛋白(tumor necrosis factor receptor-immunoglobulin G1 Fc fusion,TNFR-Fc),考察糖基工程化过程对其活性的影响.方法 将编码TNFR-Fc的cDNA序列插入毕赤酵母表达载体pPIC6αA中,构建重组表达质粒pPIC6-TF.用表达质粒转染N-糖基化工程改造的毕赤酵母菌株GSB,在含有杀稻瘟菌素的YPD平板上进行筛选.然后再使用HRP标记的羊抗人IgG在醋酸-硝酸纤维素双层膜上进行斑点印迹(dot-blot)筛选.选择表达量较高的工程菌株TNFR-Fc/GSB57进行高密度培养,通过Protein A亲和层析从发酵上清中纯化融合蛋白,利用鼠L929细胞对融合蛋白的抗TNFα活性进行分析.结果 通过筛选获得了表达人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白的表达菌株,纯化后的TNFR-Fc融合蛋白拮抗TNFα的EC50高于野生型毕赤酵母表达产物,而低于哺乳动物细胞的表达产物.结论 糖基化改造改善了人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白的抗TNFα活性,但必须进行进一步的改造才可能获得与哺乳动物细胞表达产物相似的活性.
目的 在糖基工程化畢赤酵母中錶達人Ⅱ型腫瘤壞死因子受體-免疫毬蛋白G1 Fc融閤蛋白(tumor necrosis factor receptor-immunoglobulin G1 Fc fusion,TNFR-Fc),攷察糖基工程化過程對其活性的影響.方法 將編碼TNFR-Fc的cDNA序列插入畢赤酵母錶達載體pPIC6αA中,構建重組錶達質粒pPIC6-TF.用錶達質粒轉染N-糖基化工程改造的畢赤酵母菌株GSB,在含有殺稻瘟菌素的YPD平闆上進行篩選.然後再使用HRP標記的羊抗人IgG在醋痠-硝痠纖維素雙層膜上進行斑點印跡(dot-blot)篩選.選擇錶達量較高的工程菌株TNFR-Fc/GSB57進行高密度培養,通過Protein A親和層析從髮酵上清中純化融閤蛋白,利用鼠L929細胞對融閤蛋白的抗TNFα活性進行分析.結果 通過篩選穫得瞭錶達人Ⅱ型腫瘤壞死因子受體-Fc融閤蛋白的錶達菌株,純化後的TNFR-Fc融閤蛋白拮抗TNFα的EC50高于野生型畢赤酵母錶達產物,而低于哺乳動物細胞的錶達產物.結論 糖基化改造改善瞭人Ⅱ型腫瘤壞死因子受體-Fc融閤蛋白的抗TNFα活性,但必鬚進行進一步的改造纔可能穫得與哺乳動物細胞錶達產物相似的活性.
목적 재당기공정화필적효모중표체인Ⅱ형종류배사인자수체-면역구단백G1 Fc융합단백(tumor necrosis factor receptor-immunoglobulin G1 Fc fusion,TNFR-Fc),고찰당기공정화과정대기활성적영향.방법 장편마TNFR-Fc적cDNA서렬삽입필적효모표체재체pPIC6αA중,구건중조표체질립pPIC6-TF.용표체질립전염N-당기화공정개조적필적효모균주GSB,재함유살도온균소적YPD평판상진행사선.연후재사용HRP표기적양항인IgG재작산-초산섬유소쌍층막상진행반점인적(dot-blot)사선.선택표체량교고적공정균주TNFR-Fc/GSB57진행고밀도배양,통과Protein A친화층석종발효상청중순화융합단백,이용서L929세포대융합단백적항TNFα활성진행분석.결과 통과사선획득료표체인Ⅱ형종류배사인자수체-Fc융합단백적표체균주,순화후적TNFR-Fc융합단백길항TNFα적EC50고우야생형필적효모표체산물,이저우포유동물세포적표체산물.결론 당기화개조개선료인Ⅱ형종류배사인자수체-Fc융합단백적항TNFα활성,단필수진행진일보적개조재가능획득여포유동물세포표체산물상사적활성.
