作物学报
作物學報
작물학보
ACTA AGRONOMICA SINICA
2006年
5期
755-761
,共7页
多顺反子%番茄质体载体构建%烟草质体转化%基因枪法
多順反子%番茄質體載體構建%煙草質體轉化%基因鎗法
다순반자%번가질체재체구건%연초질체전화%기인창법
根据烟草叶绿体高频同源重组片段的已知序列(GenBank Z00044.1)设计引物,用PCR的方法克隆到1个3.663kb的番茄叶绿体DNA片段(psbD/trnG),命名为ctDNA.该片段与GenBank中烟草的相应片段有96.7%同源性,与本文所用的烟草的相应片段有95.8%同源性.以其为外源多顺反子定点整合介导的同源重组片段,与来自烟草叶绿体的强启动子Prrn和终止子psbA3′,以及甘露聚糖酶基因man、绿荧光蛋白基因gfp、氨基糖苷3′-腺苷酰基转移酶基因aadA构建番茄质体多顺反子定点整合表达载体pLM2(-psbD-Prrn-RBS-man-RBS-gfp-RBS-aadA-psbA3′-trnG-).将该载体用基因枪轰击烟草叶片,用添加了壮观霉素的选择分化培养基筛选,获得质体转基因烟草3株.用PCR、激光扫描、Western blot、RFLP等方法检测都证实man、gfp、aadA基因已整合到烟草质体基因组中,且均得到表达.用番茄质体多顺反子定点整合表达载体成功实现在烟草质体中的表达.
根據煙草葉綠體高頻同源重組片段的已知序列(GenBank Z00044.1)設計引物,用PCR的方法剋隆到1箇3.663kb的番茄葉綠體DNA片段(psbD/trnG),命名為ctDNA.該片段與GenBank中煙草的相應片段有96.7%同源性,與本文所用的煙草的相應片段有95.8%同源性.以其為外源多順反子定點整閤介導的同源重組片段,與來自煙草葉綠體的彊啟動子Prrn和終止子psbA3′,以及甘露聚糖酶基因man、綠熒光蛋白基因gfp、氨基糖苷3′-腺苷酰基轉移酶基因aadA構建番茄質體多順反子定點整閤錶達載體pLM2(-psbD-Prrn-RBS-man-RBS-gfp-RBS-aadA-psbA3′-trnG-).將該載體用基因鎗轟擊煙草葉片,用添加瞭壯觀黴素的選擇分化培養基篩選,穫得質體轉基因煙草3株.用PCR、激光掃描、Western blot、RFLP等方法檢測都證實man、gfp、aadA基因已整閤到煙草質體基因組中,且均得到錶達.用番茄質體多順反子定點整閤錶達載體成功實現在煙草質體中的錶達.
근거연초협록체고빈동원중조편단적이지서렬(GenBank Z00044.1)설계인물,용PCR적방법극륭도1개3.663kb적번가협록체DNA편단(psbD/trnG),명명위ctDNA.해편단여GenBank중연초적상응편단유96.7%동원성,여본문소용적연초적상응편단유95.8%동원성.이기위외원다순반자정점정합개도적동원중조편단,여래자연초협록체적강계동자Prrn화종지자psbA3′,이급감로취당매기인man、록형광단백기인gfp、안기당감3′-선감선기전이매기인aadA구건번가질체다순반자정점정합표체재체pLM2(-psbD-Prrn-RBS-man-RBS-gfp-RBS-aadA-psbA3′-trnG-).장해재체용기인창굉격연초협편,용첨가료장관매소적선택분화배양기사선,획득질체전기인연초3주.용PCR、격광소묘、Western blot、RFLP등방법검측도증실man、gfp、aadA기인이정합도연초질체기인조중,차균득도표체.용번가질체다순반자정점정합표체재체성공실현재연초질체중적표체.
