CAJ | 학술논문

为探讨不同原核表达载体、不同表达温度对重组表达Eimeria tenella丙二酸单酰辅酶A:ACP转移酶活性的影响,以生物信息学技术预测的E.tenellaⅡ型脂肪酸合成代谢途径中的丙二酰单酰辅酶A:ACP转移酶(EtMCAT)编序列为基础,分别设计引物扩增完整ORF,采取截除信号肽而保留转导肽以及切除信号肽和转导肽的不同策略,选择pMAL-c2x、pET-32a(+)和pProExHTa 3种不同表达载体分别构建重组表达质粒,转化大肠杆菌Rosseta(DE3)后,在不同条件下诱导表达,利用酮戊二酸脱氢酶(KDH)偶联系统测定表达产物的酶活性,以评价不同表达策略对表达效果和表达产物活性的影响.表达水平和酶活性分析结果显示,惟切除信号肽和转导肽后的功能蛋白编码区能表达,Rosseta(DE3)/pMAL-c2x-mcat体系的可溶性表达量高于Rosseta(DE3)/pET-32a(+)mcat,但二者表达产物的酶活性相似,且均随着诱导温度的降低其可溶性蛋白表达量增加.但Rosseta(DE3)/pProExHTa-mcat体系仅能表达不溶性蛋白,且复性后无酶活性,改变诱导温度对表达效果无明显影响.结果表明不同表达载体和诱导温度对大肠杆菌所表达EtMCAT的活性及其表达形式有显著影响,其中融合标签和表达温度可能是主要的影响因素,包涵体表达的重组酶即使复性处理仍难达到酶活性分析的要求.
위탐토불동원핵표체재체、불동표체온도대중조표체Eimeria tenella병이산단선보매A:ACP전이매활성적영향,이생물신식학기술예측적E.tenellaⅡ형지방산합성대사도경중적병이선단선보매A:ACP전이매(EtMCAT)편서렬위기출,분별설계인물확증완정ORF,채취절제신호태이보류전도태이급절제신호태화전도태적불동책략,선택pMAL-c2x、pET-32a(+)화pProExHTa 3충불동표체재체분별구건중조표체질립,전화대장간균Rosseta(DE3)후,재불동조건하유도표체,이용동무이산탈경매(KDH)우련계통측정표체산물적매활성,이평개불동표체책략대표체효과화표체산물활성적영향.표체수평화매활성분석결과현시,유절제신호태화전도태후적공능단백편마구능표체,Rosseta(DE3)/pMAL-c2x-mcat체계적가용성표체량고우Rosseta(DE3)/pET-32a(+)mcat,단이자표체산물적매활성상사,차균수착유도온도적강저기가용성단백표체량증가.단Rosseta(DE3)/pProExHTa-mcat체계부능표체불용성단백,차복성후무매활성,개변유도온도대표체효과무명현영향.결과표명불동표체재체화유도온도대대장간균소표체EtMCAT적활성급기표체형식유현저영향,기중융합표첨화표체온도가능시주요적영향인소,포함체표체적중조매즉사복성처리잉난체도매활성분석적요구.