基础医学与临床
基礎醫學與臨床
기출의학여림상
BASIC MEDICAL SCIENCES AND CLINICS
2012年
6期
697-701
,共5页
陈特%刘宇思%谌海兰%陈曦%王虹%张雪梅%胥文春
陳特%劉宇思%諶海蘭%陳晞%王虹%張雪梅%胥文春
진특%류우사%심해란%진희%왕홍%장설매%서문춘
胱抑素C%原核表达%蛋白纯化%蛋白标准品
胱抑素C%原覈錶達%蛋白純化%蛋白標準品
광억소C%원핵표체%단백순화%단백표준품
目的 构建人胱抑素C(CysC)基因的原核表达质粒pCold TF-CysC,表达并制备去标签蛋白的CysC.方法 用人CysC的全长编码基因插入原核表达载体pCold TF并测序鉴定.将重组质粒转化到大肠杆菌BL21 (DE3),经IPTG诱导、镍柱纯化后获得带有His标签的重组蛋白TF-CysC.利用GST-HRV 3C蛋白酶去除该融合蛋白的TF标签,再经分子筛一步法同时去除TF标签、3C蛋白酶获得CysC,SDS-PAGE鉴定其纯度.用该CysC免疫新西兰大白兔,制备抗血清,并用间接ELISA及Western blot鉴定.结果 测序结果与Genbank中人CysC序列一致,实现了CysC可溶性高表达.纯化的无标签CysC纯度大于95％,分子质量约为13.3 ku,与预期相符.免疫家兔后,获得的抗血清效价达到1:4×106以上,能特异性识别市售CysC蛋白.该蛋白稳定性良好,在4℃保存一个月未见明显下降.结论 成功应用原核表达系统,获得了可用作免疫诊断试剂标准品的CysC,为进一步建立CysC的免疫检测方法奠定了基础.
目的 構建人胱抑素C(CysC)基因的原覈錶達質粒pCold TF-CysC,錶達併製備去標籤蛋白的CysC.方法 用人CysC的全長編碼基因插入原覈錶達載體pCold TF併測序鑒定.將重組質粒轉化到大腸桿菌BL21 (DE3),經IPTG誘導、鎳柱純化後穫得帶有His標籤的重組蛋白TF-CysC.利用GST-HRV 3C蛋白酶去除該融閤蛋白的TF標籤,再經分子篩一步法同時去除TF標籤、3C蛋白酶穫得CysC,SDS-PAGE鑒定其純度.用該CysC免疫新西蘭大白兔,製備抗血清,併用間接ELISA及Western blot鑒定.結果 測序結果與Genbank中人CysC序列一緻,實現瞭CysC可溶性高錶達.純化的無標籤CysC純度大于95％,分子質量約為13.3 ku,與預期相符.免疫傢兔後,穫得的抗血清效價達到1:4×106以上,能特異性識彆市售CysC蛋白.該蛋白穩定性良好,在4℃保存一箇月未見明顯下降.結論 成功應用原覈錶達繫統,穫得瞭可用作免疫診斷試劑標準品的CysC,為進一步建立CysC的免疫檢測方法奠定瞭基礎.
목적 구건인광억소C(CysC)기인적원핵표체질립pCold TF-CysC,표체병제비거표첨단백적CysC.방법 용인CysC적전장편마기인삽입원핵표체재체pCold TF병측서감정.장중조질립전화도대장간균BL21 (DE3),경IPTG유도、얼주순화후획득대유His표첨적중조단백TF-CysC.이용GST-HRV 3C단백매거제해융합단백적TF표첨,재경분자사일보법동시거제TF표첨、3C단백매획득CysC,SDS-PAGE감정기순도.용해CysC면역신서란대백토,제비항혈청,병용간접ELISA급Western blot감정.결과 측서결과여Genbank중인CysC서렬일치,실현료CysC가용성고표체.순화적무표첨CysC순도대우95％,분자질량약위13.3 ku,여예기상부.면역가토후,획득적항혈청효개체도1:4×106이상,능특이성식별시수CysC단백.해단백은정성량호,재4℃보존일개월미견명현하강.결론 성공응용원핵표체계통,획득료가용작면역진단시제표준품적CysC,위진일보건립CysC적면역검측방법전정료기출.
