中国病理生理杂志
中國病理生理雜誌
중국병리생리잡지
CHINESE JOURNAL OF PATHOPHYSIOLOGY
2006年
9期
1802-1807
,共6页
周林福%朱毅%朱自路%殷凯生
週林福%硃毅%硃自路%慇凱生
주림복%주의%주자로%은개생
克隆,分子%IκBα突变体%NF-κB%腺病毒科%基因疗法%哮喘
剋隆,分子%IκBα突變體%NF-κB%腺病毒科%基因療法%哮喘
극륭,분자%IκBα돌변체%NF-κB%선병독과%기인요법%효천
目的:通过去除N端丝氨酸32/36磷酸化位点,获得人胎盘组织IκBα突变体(IκBαM)基因,构建其复制缺陷型重组腺病毒(AdIκBαM),并进行体外表达和活性检测.方法:PCR定点克隆IκBαM基因(203-1003bp),亚克隆至pShuttle和pGEM-T,进行PCR、双酶切、DNA测序和同源性分析.将重组质粒pShuttle-IκBαM中含CMV启动子、IκBαM cDNA和PolyA信号的表达单元定向插入Ad5腺病毒载体,构建成重组腺病毒AdIκBαM,再经脂质体介导共转染293细胞进行包装.Western blotting检测AdIκBαM在293细胞中蛋白表达情况,电泳迁移率实验观察AdIκBαM抑制佛波酯诱导的ECV304细胞核因子κB(NF-κB)激活的作用.结果:成功克隆长801 bp的新型IκBαM基因,与GenBank中登陆的IκBα基因(接受号M69043)相应核苷酸序列一致.所制备的AdIκBαM滴度为4.0×1012pfu/L.AdIκBαM介导IκBαM基因在293细胞中表达,并以剂量依赖性方式显著抑制佛波酯诱导的ECV304细胞NF-κB活化.结论:AdIκBαM有效介导IκBαM基因表达并特异性抑制NF-κB活性,有望应用于哮喘的基因治疗.
目的:通過去除N耑絲氨痠32/36燐痠化位點,穫得人胎盤組織IκBα突變體(IκBαM)基因,構建其複製缺陷型重組腺病毒(AdIκBαM),併進行體外錶達和活性檢測.方法:PCR定點剋隆IκBαM基因(203-1003bp),亞剋隆至pShuttle和pGEM-T,進行PCR、雙酶切、DNA測序和同源性分析.將重組質粒pShuttle-IκBαM中含CMV啟動子、IκBαM cDNA和PolyA信號的錶達單元定嚮插入Ad5腺病毒載體,構建成重組腺病毒AdIκBαM,再經脂質體介導共轉染293細胞進行包裝.Western blotting檢測AdIκBαM在293細胞中蛋白錶達情況,電泳遷移率實驗觀察AdIκBαM抑製彿波酯誘導的ECV304細胞覈因子κB(NF-κB)激活的作用.結果:成功剋隆長801 bp的新型IκBαM基因,與GenBank中登陸的IκBα基因(接受號M69043)相應覈苷痠序列一緻.所製備的AdIκBαM滴度為4.0×1012pfu/L.AdIκBαM介導IκBαM基因在293細胞中錶達,併以劑量依賴性方式顯著抑製彿波酯誘導的ECV304細胞NF-κB活化.結論:AdIκBαM有效介導IκBαM基因錶達併特異性抑製NF-κB活性,有望應用于哮喘的基因治療.
목적:통과거제N단사안산32/36린산화위점,획득인태반조직IκBα돌변체(IκBαM)기인,구건기복제결함형중조선병독(AdIκBαM),병진행체외표체화활성검측.방법:PCR정점극륭IκBαM기인(203-1003bp),아극륭지pShuttle화pGEM-T,진행PCR、쌍매절、DNA측서화동원성분석.장중조질립pShuttle-IκBαM중함CMV계동자、IκBαM cDNA화PolyA신호적표체단원정향삽입Ad5선병독재체,구건성중조선병독AdIκBαM,재경지질체개도공전염293세포진행포장.Western blotting검측AdIκBαM재293세포중단백표체정황,전영천이솔실험관찰AdIκBαM억제불파지유도적ECV304세포핵인자κB(NF-κB)격활적작용.결과:성공극륭장801 bp적신형IκBαM기인,여GenBank중등륙적IκBα기인(접수호M69043)상응핵감산서렬일치.소제비적AdIκBαM적도위4.0×1012pfu/L.AdIκBαM개도IκBαM기인재293세포중표체,병이제량의뢰성방식현저억제불파지유도적ECV304세포NF-κB활화.결론:AdIκBαM유효개도IκBαM기인표체병특이성억제NF-κB활성,유망응용우효천적기인치료.
