江苏农业学报
江囌農業學報
강소농업학보
JIANGSU JOURNAL OF AGRICULTURAL SCIENCES
2010年
6期
1270-1276
,共7页
传染性法氏囊病病毒(IBDV)%VP2%miRNA%荧光共聚焦%流式细胞术
傳染性法氏囊病病毒(IBDV)%VP2%miRNA%熒光共聚焦%流式細胞術
전염성법씨낭병병독(IBDV)%VP2%miRNA%형광공취초%류식세포술
为筛选出能有效抑制传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2基因复制的miRNA,采用RT-PCR方法从病毒基因组中进行结构蛋白VP2的基因扩增与序列测定,构建融合表达载体pVP2-EGFP.根据VP2测序结果,借助genscript软件设计针对VP2的5条miRNA,分别命名为miVP2A、miVP2B、miVP2C,miVP2D和miVP2E,将合成的5条miRNAs分别插入到pRFPRNAiC中形成miVP2s表达载体,这些载体分别与pVP2-EGFP共转染DF-1细胞系,通过Northering Blotting方法检测miVP2s的表达,利用荧光共聚焦显微镜定性、流式细胞术定量的方法进行有效miVP2s的筛选.结果显示:miVP2s能成功表达;转染miVP2s表达载体组的绿色荧光蛋白(GFP)强度和数量都明显弱于或少于阴性对照组;miVP2s对VP2的抑制效率为59.7%到78.5%.表明所设计的miRNAs对VP2均有抑制作用,其中miVP2A和miVP2E效果最为显著.
為篩選齣能有效抑製傳染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2基因複製的miRNA,採用RT-PCR方法從病毒基因組中進行結構蛋白VP2的基因擴增與序列測定,構建融閤錶達載體pVP2-EGFP.根據VP2測序結果,藉助genscript軟件設計針對VP2的5條miRNA,分彆命名為miVP2A、miVP2B、miVP2C,miVP2D和miVP2E,將閤成的5條miRNAs分彆插入到pRFPRNAiC中形成miVP2s錶達載體,這些載體分彆與pVP2-EGFP共轉染DF-1細胞繫,通過Northering Blotting方法檢測miVP2s的錶達,利用熒光共聚焦顯微鏡定性、流式細胞術定量的方法進行有效miVP2s的篩選.結果顯示:miVP2s能成功錶達;轉染miVP2s錶達載體組的綠色熒光蛋白(GFP)彊度和數量都明顯弱于或少于陰性對照組;miVP2s對VP2的抑製效率為59.7%到78.5%.錶明所設計的miRNAs對VP2均有抑製作用,其中miVP2A和miVP2E效果最為顯著.
위사선출능유효억제전염성법씨낭병병독(IBDV)VP2기인복제적miRNA,채용RT-PCR방법종병독기인조중진행결구단백VP2적기인확증여서렬측정,구건융합표체재체pVP2-EGFP.근거VP2측서결과,차조genscript연건설계침대VP2적5조miRNA,분별명명위miVP2A、miVP2B、miVP2C,miVP2D화miVP2E,장합성적5조miRNAs분별삽입도pRFPRNAiC중형성miVP2s표체재체,저사재체분별여pVP2-EGFP공전염DF-1세포계,통과Northering Blotting방법검측miVP2s적표체,이용형광공취초현미경정성、류식세포술정량적방법진행유효miVP2s적사선.결과현시:miVP2s능성공표체;전염miVP2s표체재체조적록색형광단백(GFP)강도화수량도명현약우혹소우음성대조조;miVP2s대VP2적억제효솔위59.7%도78.5%.표명소설계적miRNAs대VP2균유억제작용,기중miVP2A화miVP2E효과최위현저.