CAJ | 학술논문

目的构建带有U6启动子的人端粒酶催化亚单位锤头状核酶真核表达质粒及其突变体,转染人肝癌细胞株SMMC7721,观察端粒酶活性、细胞增殖和凋亡的情况.方法用分子克隆技术构建由U6作为启动子、绿色荧光蛋白基因作为报告基因的核酶真核表达质粒pGTRz-U6及其突变体pGTmRz-U6,并以空质粒pEGFP-C1作为对照.Lipofectamine2000转染人肝癌细胞株SMMC7721,G418筛选阳性克隆.RT-PCR检测核酶及hTERT基因的表达,四甲基偶氮唑盐(MTT)作细胞生长曲线观察其生长情况,TRAP-银染法检测端粒酶活性变化,流式细胞计数(FCM)法检测细胞的凋亡水平. 结果核酶、突变核酶在SMMC7721中持续表达;凝胶成像系统分析SMMC7721-pEGFP-C1、SMMC7721-mRz、SMMC7721-Rz hTERT基因表达,用SPSS10.0软件对3种细胞进行分析,发现三者hTERT基因表达水平不同(F=47.987,P＜0.01);t检验分析得出SMMC7721-Rz hTERT基因表达明显低于SMMC7721 mRz和SMMC7721-pEGFP-C1(t值分别为-7.640和-11.602,P值均＜0.01).SMMC7721-pEGFP-C1和SMMC7721-mRz hTERT表达没有区别(t=0.178,P＞0.05).TRAP-银染及FCM结果分别显示,随着细胞的分裂,SMMC7721-Rz和SMMC7721-mRz细胞端粒酶活性逐渐降低,凋亡水平逐渐增加,7PDS细胞凋亡率分别是29.86%和9.87%,而对照组SMMC7721-pEGFP-C1凋亡率为3.36%.结论与突变核酶及空质粒相比,带有U6启动子的人端粒酶hTERT锤头状核酶具有明显降低hTERT表达和端粒酶活性,诱导细胞凋亡的作用,并且此作用随着细胞的分裂而逐渐增强,因此有望成为肝癌基因治疗的有效手段.
목적구건대유U6계동자적인단립매최화아단위추두상핵매진핵표체질립급기돌변체,전염인간암세포주SMMC7721,관찰단립매활성、세포증식화조망적정황.방법용분자극륭기술구건유U6작위계동자、록색형광단백기인작위보고기인적핵매진핵표체질립pGTRz-U6급기돌변체pGTmRz-U6,병이공질립pEGFP-C1작위대조.Lipofectamine2000전염인간암세포주SMMC7721,G418사선양성극륭.RT-PCR검측핵매급hTERT기인적표체,사갑기우담서염(MTT)작세포생장곡선관찰기생장정황,TRAP-은염법검측단립매활성변화,류식세포계수(FCM)법검측세포적조망수평. 결과핵매、돌변핵매재SMMC7721중지속표체;응효성상계통분석SMMC7721-pEGFP-C1、SMMC7721-mRz、SMMC7721-Rz hTERT기인표체,용SPSS10.0연건대3충세포진행분석,발현삼자hTERT기인표체수평불동(F=47.987,P＜0.01);t검험분석득출SMMC7721-Rz hTERT기인표체명현저우SMMC7721 mRz화SMMC7721-pEGFP-C1(t치분별위-7.640화-11.602,P치균＜0.01).SMMC7721-pEGFP-C1화SMMC7721-mRz hTERT표체몰유구별(t=0.178,P＞0.05).TRAP-은염급FCM결과분별현시,수착세포적분렬,SMMC7721-Rz화SMMC7721-mRz세포단립매활성축점강저,조망수평축점증가,7PDS세포조망솔분별시29.86%화9.87%,이대조조SMMC7721-pEGFP-C1조망솔위3.36%.결론여돌변핵매급공질립상비,대유U6계동자적인단립매hTERT추두상핵매구유명현강저hTERT표체화단립매활성,유도세포조망적작용,병차차작용수착세포적분렬이축점증강,인차유망성위간암기인치료적유효수단.