医学分子生物学杂志
醫學分子生物學雜誌
의학분자생물학잡지
FOREIGN MEDICAL SCIENCES
2008年
4期
303-308
,共6页
毕杨%何昀%黄佳祎%张琴%王瑜伟%赵迎泽%冯涛
畢楊%何昀%黃佳祎%張琴%王瑜偉%趙迎澤%馮濤
필양%하윤%황가의%장금%왕유위%조영택%풍도
自杀基因%SV40T抗原%肝细胞永生化%Cre/loxP位点特异性重组系统
自殺基因%SV40T抗原%肝細胞永生化%Cre/loxP位點特異性重組繫統
자살기인%SV40T항원%간세포영생화%Cre/loxP위점특이성중조계통
目的 构建携带双自杀基因且可诱导敲除SV40T的逆转录病毒载体,优化目前的肝细胞永生化.方法 去除eGFP终止子taa的pSEB-HUS质粒为逆转录病毒基础质粒.先将SV40T及其启动子hEFH亚克隆至pSEB-HUS,再将LoxP位点插入至pSEB-SV40T质粒的抗性基因Blasticidin上游获得pSEB-LoxP-SV40T质粒.同时将CD自杀基因定向克隆至pSEB-HUS的eGFP下游;然后设计一段HSV-tk自杀基因引物,在上游引物的5'端加入方向一致的LoxP序列.PCR获得TK基因后,定向克隆至CD下游获得pSEB-CD-TK,最后将pSEB-CD-TK上的双自杀基因亚克隆至pSEB-LocP-SV40T质粒上得到携带双自杀基因及SV40T的质粒.结果 PCR及酶切鉴定均证实两个自杀基因及SV40T正确克隆至逆转录病毒质粒中,目的基因序列与GenBank报道一致,两个LoxP位点方向相同.结论 成功构建携带双自杀基因且可诱导敲除SV40T的逆转录病毒载体.
目的 構建攜帶雙自殺基因且可誘導敲除SV40T的逆轉錄病毒載體,優化目前的肝細胞永生化.方法 去除eGFP終止子taa的pSEB-HUS質粒為逆轉錄病毒基礎質粒.先將SV40T及其啟動子hEFH亞剋隆至pSEB-HUS,再將LoxP位點插入至pSEB-SV40T質粒的抗性基因Blasticidin上遊穫得pSEB-LoxP-SV40T質粒.同時將CD自殺基因定嚮剋隆至pSEB-HUS的eGFP下遊;然後設計一段HSV-tk自殺基因引物,在上遊引物的5'耑加入方嚮一緻的LoxP序列.PCR穫得TK基因後,定嚮剋隆至CD下遊穫得pSEB-CD-TK,最後將pSEB-CD-TK上的雙自殺基因亞剋隆至pSEB-LocP-SV40T質粒上得到攜帶雙自殺基因及SV40T的質粒.結果 PCR及酶切鑒定均證實兩箇自殺基因及SV40T正確剋隆至逆轉錄病毒質粒中,目的基因序列與GenBank報道一緻,兩箇LoxP位點方嚮相同.結論 成功構建攜帶雙自殺基因且可誘導敲除SV40T的逆轉錄病毒載體.
목적 구건휴대쌍자살기인차가유도고제SV40T적역전록병독재체,우화목전적간세포영생화.방법 거제eGFP종지자taa적pSEB-HUS질립위역전록병독기출질립.선장SV40T급기계동자hEFH아극륭지pSEB-HUS,재장LoxP위점삽입지pSEB-SV40T질립적항성기인Blasticidin상유획득pSEB-LoxP-SV40T질립.동시장CD자살기인정향극륭지pSEB-HUS적eGFP하유;연후설계일단HSV-tk자살기인인물,재상유인물적5'단가입방향일치적LoxP서렬.PCR획득TK기인후,정향극륭지CD하유획득pSEB-CD-TK,최후장pSEB-CD-TK상적쌍자살기인아극륭지pSEB-LocP-SV40T질립상득도휴대쌍자살기인급SV40T적질립.결과 PCR급매절감정균증실량개자살기인급SV40T정학극륭지역전록병독질립중,목적기인서렬여GenBank보도일치,량개LoxP위점방향상동.결론 성공구건휴대쌍자살기인차가유도고제SV40T적역전록병독재체.
