病毒学报
病毒學報
병독학보
CHINESE JOURNAL OF VIROLOGY
2006年
6期
456-461
,共6页
苏鑫铭%于春梅%王敏秀%陈勇军%曹瑞兵%周斌%陈溥言
囌鑫銘%于春梅%王敏秀%陳勇軍%曹瑞兵%週斌%陳溥言
소흠명%우춘매%왕민수%진용군%조서병%주빈%진부언
疱疹病毒科%伪狂犬病病毒%TK基因%Cre重组酶%LoxP序列%GFP
皰疹病毒科%偽狂犬病病毒%TK基因%Cre重組酶%LoxP序列%GFP
포진병독과%위광견병병독%TK기인%Cre중조매%LoxP서렬%GFP
根据pEGFP-C1序列,设计并合成一对引物,通过PCR扩增出两端各含一个同向LoxP位点的GFP表达盒,克隆于转移载体pSKLR获得pSKLR-G-LoxP.通过经典同源重组方法,得到表达GFP的TK基因缺失伪狂犬病毒重组毒株S03109.该重组病毒在转染了pOG231(表达Cre重组酶)的293T细胞上连续传代,筛选得到重组病毒株S0419.荧光显微镜观察、Western blot及PCR检测结果表明,S03109感染细胞后持续表达GFP,而S0419不表达GFP.PCR 证实S0419为含单个LoxP位点的TK基因缺失病毒,并且在细胞培养上遗传稳定,测序结果(GenBank登录号AY822465)表明,在Cre重组酶的作用下,两个同向LoxP序列之间的GFP表达盒被正确除去.对BALB/c小鼠的半数致死量(LD50)及免疫保护实验结果表明,S03109和S0419对BALB/c小鼠的LD50值均大于3×105PFU,免疫BALB/c小鼠,攻毒后平均存活率分别为67.5%与70%.以上结果表明,利用Cre/LoxP位点特异性重组系统,成功去除了插入重组伪狂犬病病毒基因组中的GFP报告基因.
根據pEGFP-C1序列,設計併閤成一對引物,通過PCR擴增齣兩耑各含一箇同嚮LoxP位點的GFP錶達盒,剋隆于轉移載體pSKLR穫得pSKLR-G-LoxP.通過經典同源重組方法,得到錶達GFP的TK基因缺失偽狂犬病毒重組毒株S03109.該重組病毒在轉染瞭pOG231(錶達Cre重組酶)的293T細胞上連續傳代,篩選得到重組病毒株S0419.熒光顯微鏡觀察、Western blot及PCR檢測結果錶明,S03109感染細胞後持續錶達GFP,而S0419不錶達GFP.PCR 證實S0419為含單箇LoxP位點的TK基因缺失病毒,併且在細胞培養上遺傳穩定,測序結果(GenBank登錄號AY822465)錶明,在Cre重組酶的作用下,兩箇同嚮LoxP序列之間的GFP錶達盒被正確除去.對BALB/c小鼠的半數緻死量(LD50)及免疫保護實驗結果錶明,S03109和S0419對BALB/c小鼠的LD50值均大于3×105PFU,免疫BALB/c小鼠,攻毒後平均存活率分彆為67.5%與70%.以上結果錶明,利用Cre/LoxP位點特異性重組繫統,成功去除瞭插入重組偽狂犬病病毒基因組中的GFP報告基因.
근거pEGFP-C1서렬,설계병합성일대인물,통과PCR확증출량단각함일개동향LoxP위점적GFP표체합,극륭우전이재체pSKLR획득pSKLR-G-LoxP.통과경전동원중조방법,득도표체GFP적TK기인결실위광견병독중조독주S03109.해중조병독재전염료pOG231(표체Cre중조매)적293T세포상련속전대,사선득도중조병독주S0419.형광현미경관찰、Western blot급PCR검측결과표명,S03109감염세포후지속표체GFP,이S0419불표체GFP.PCR 증실S0419위함단개LoxP위점적TK기인결실병독,병차재세포배양상유전은정,측서결과(GenBank등록호AY822465)표명,재Cre중조매적작용하,량개동향LoxP서렬지간적GFP표체합피정학제거.대BALB/c소서적반수치사량(LD50)급면역보호실험결과표명,S03109화S0419대BALB/c소서적LD50치균대우3×105PFU,면역BALB/c소서,공독후평균존활솔분별위67.5%여70%.이상결과표명,이용Cre/LoxP위점특이성중조계통,성공거제료삽입중조위광견병병독기인조중적GFP보고기인.
