中国病理生理杂志
中國病理生理雜誌
중국병리생리잡지
CHINESE JOURNAL OF PATHOPHYSIOLOGY
2012年
9期
1633-1638
,共6页
汤绍辉%张良鹏%吴小娟%张嫚嫚%王旷靖%周鸿科%罗羽宏%曹明溶
湯紹輝%張良鵬%吳小娟%張嫚嫚%王曠靖%週鴻科%囉羽宏%曹明溶
탕소휘%장량붕%오소연%장만만%왕광정%주홍과%라우굉%조명용
乙型肝炎病毒X蛋白%胰岛素样生长因子II%启动子%DNA甲基化
乙型肝炎病毒X蛋白%胰島素樣生長因子II%啟動子%DNA甲基化
을형간염병독X단백%이도소양생장인자II%계동자%DNA갑기화
目的:构建稳定表达乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)的肝癌细胞株HepG2-HBx,探讨HBx对胰岛素样生长因子 II(IGF-II)基因P4启动子甲基化水平及转录表达的影响.方法:应用基因重组技术,构建含HBx基因的重组逆转录病毒载体pBABE-puro-HBx,采用磷酸钙共沉淀法将其转染293FT包装细胞产生逆转录病毒,感染HepG2肝癌细胞,采用嘌呤霉素进行阳性克隆筛选,Western blotting鉴定表达HBx蛋白的肝癌细胞株HepG2-HBx.采用亚硫酸氢盐测序法及实时荧光定量RT-PCR检测HepG2-HBx细胞中P4启动子甲基化水平及P4 mRNA表达水平变化.进一步将体外甲基化的人IGF-II基因P4启动子驱动的荧光素酶报告载体pGL3-P4及含HBx基因的pCMV-tag2B-X质粒共转染HepG2肝癌细胞,采用亚硫酸氢盐测序法及双萤光素酶实验检测pGL3-P4载体上P4启动子甲基化水平及转录调控活性变化.结果:(1)经Western blotting鉴定,成功构建了稳定表达HBx蛋白的肝癌细胞株HepG2-HBx;(2)表达HBx蛋白的HepG2-HBx细胞中P4启动子甲基化CpG位点的比例(9.0%)明显低于对照细胞HepG2-control(25.0%)(P<0.01),而其P4 mRNA表达水平则为对照细胞HepG2-control的2.8倍;(3)共转染pCMV-tag2B-X质粒的HepG2细胞中pGL3-P4载体上P4启动子甲基化CpG位点的比例(60.8%)明显低于共转染对照质粒pCMV-tag2B的HepG2细胞(84.1%)(P<0.01),而前者P4启动子相对萤光素酶活性(14.12±0.89)则明显高于后者(4.61±0.76)(P<0.01).结论:HBx蛋白可降低IGF-II基因P4启动子甲基化水平,进而上调其转录表达.
目的:構建穩定錶達乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)的肝癌細胞株HepG2-HBx,探討HBx對胰島素樣生長因子 II(IGF-II)基因P4啟動子甲基化水平及轉錄錶達的影響.方法:應用基因重組技術,構建含HBx基因的重組逆轉錄病毒載體pBABE-puro-HBx,採用燐痠鈣共沉澱法將其轉染293FT包裝細胞產生逆轉錄病毒,感染HepG2肝癌細胞,採用嘌呤黴素進行暘性剋隆篩選,Western blotting鑒定錶達HBx蛋白的肝癌細胞株HepG2-HBx.採用亞硫痠氫鹽測序法及實時熒光定量RT-PCR檢測HepG2-HBx細胞中P4啟動子甲基化水平及P4 mRNA錶達水平變化.進一步將體外甲基化的人IGF-II基因P4啟動子驅動的熒光素酶報告載體pGL3-P4及含HBx基因的pCMV-tag2B-X質粒共轉染HepG2肝癌細胞,採用亞硫痠氫鹽測序法及雙螢光素酶實驗檢測pGL3-P4載體上P4啟動子甲基化水平及轉錄調控活性變化.結果:(1)經Western blotting鑒定,成功構建瞭穩定錶達HBx蛋白的肝癌細胞株HepG2-HBx;(2)錶達HBx蛋白的HepG2-HBx細胞中P4啟動子甲基化CpG位點的比例(9.0%)明顯低于對照細胞HepG2-control(25.0%)(P<0.01),而其P4 mRNA錶達水平則為對照細胞HepG2-control的2.8倍;(3)共轉染pCMV-tag2B-X質粒的HepG2細胞中pGL3-P4載體上P4啟動子甲基化CpG位點的比例(60.8%)明顯低于共轉染對照質粒pCMV-tag2B的HepG2細胞(84.1%)(P<0.01),而前者P4啟動子相對螢光素酶活性(14.12±0.89)則明顯高于後者(4.61±0.76)(P<0.01).結論:HBx蛋白可降低IGF-II基因P4啟動子甲基化水平,進而上調其轉錄錶達.
목적:구건은정표체을형간염병독X단백(HBx)적간암세포주HepG2-HBx,탐토HBx대이도소양생장인자 II(IGF-II)기인P4계동자갑기화수평급전록표체적영향.방법:응용기인중조기술,구건함HBx기인적중조역전록병독재체pBABE-puro-HBx,채용린산개공침정법장기전염293FT포장세포산생역전록병독,감염HepG2간암세포,채용표령매소진행양성극륭사선,Western blotting감정표체HBx단백적간암세포주HepG2-HBx.채용아류산경염측서법급실시형광정량RT-PCR검측HepG2-HBx세포중P4계동자갑기화수평급P4 mRNA표체수평변화.진일보장체외갑기화적인IGF-II기인P4계동자구동적형광소매보고재체pGL3-P4급함HBx기인적pCMV-tag2B-X질립공전염HepG2간암세포,채용아류산경염측서법급쌍형광소매실험검측pGL3-P4재체상P4계동자갑기화수평급전록조공활성변화.결과:(1)경Western blotting감정,성공구건료은정표체HBx단백적간암세포주HepG2-HBx;(2)표체HBx단백적HepG2-HBx세포중P4계동자갑기화CpG위점적비례(9.0%)명현저우대조세포HepG2-control(25.0%)(P<0.01),이기P4 mRNA표체수평칙위대조세포HepG2-control적2.8배;(3)공전염pCMV-tag2B-X질립적HepG2세포중pGL3-P4재체상P4계동자갑기화CpG위점적비례(60.8%)명현저우공전염대조질립pCMV-tag2B적HepG2세포(84.1%)(P<0.01),이전자P4계동자상대형광소매활성(14.12±0.89)칙명현고우후자(4.61±0.76)(P<0.01).결론:HBx단백가강저IGF-II기인P4계동자갑기화수평,진이상조기전록표체.
