中国中西医结合肾病杂志
中國中西醫結閤腎病雜誌
중국중서의결합신병잡지
CHINESE JOURNAL OF INTEGRATED TRADITIONAL AND WESTERN NEPHROLOGY
2010年
6期
478-481,后插一
,共5页
RNAi%Megalin%肾小管上皮细胞
RNAi%Megalin%腎小管上皮細胞
RNAi%Megalin%신소관상피세포
目的:为探讨沉默Megalin基因对肾小管上皮细胞Megalin蛋白诱导表达的抑制作用,构建长期下调Megalin蛋白表达的慢病毒载体作为研究工具.方法:分别用30,50,80,100 nmol/L siRNA或对照siRNA转染人HK-2细胞,48 h后用免疫荧光和RT-PCR鉴定Megalin基因表达筛选有效的序列,用有效或对照组序列的正义链和反义链,中间加loop环,两端加入XhoⅠ和hindⅢ的酶切位点作为目的序列,经过XhoⅠ和HindⅢ双酶切的慢病毒载体质粒PLL3.7作为载体,将目的序列与载体连接,转化到XL-10Gold高感受态大肠杆菌中,XhoⅠ和HindⅢ双酶切初步鉴定,测序进一步鉴定正确的序列.得到长期下调人Megalin基因表达的慢病毒载体,并包装慢病毒感染人HK-2细胞,免疫组化鉴定干扰有效,以此获取Megalin表达下调的HK-2细胞株.结果与结论:成功筛选出有效干扰人Megalin基因的siRNA,通过慢病毒感染成功获得长期稳定下调人Megalin表达的肾小管上皮细胞株.
目的:為探討沉默Megalin基因對腎小管上皮細胞Megalin蛋白誘導錶達的抑製作用,構建長期下調Megalin蛋白錶達的慢病毒載體作為研究工具.方法:分彆用30,50,80,100 nmol/L siRNA或對照siRNA轉染人HK-2細胞,48 h後用免疫熒光和RT-PCR鑒定Megalin基因錶達篩選有效的序列,用有效或對照組序列的正義鏈和反義鏈,中間加loop環,兩耑加入XhoⅠ和hindⅢ的酶切位點作為目的序列,經過XhoⅠ和HindⅢ雙酶切的慢病毒載體質粒PLL3.7作為載體,將目的序列與載體連接,轉化到XL-10Gold高感受態大腸桿菌中,XhoⅠ和HindⅢ雙酶切初步鑒定,測序進一步鑒定正確的序列.得到長期下調人Megalin基因錶達的慢病毒載體,併包裝慢病毒感染人HK-2細胞,免疫組化鑒定榦擾有效,以此穫取Megalin錶達下調的HK-2細胞株.結果與結論:成功篩選齣有效榦擾人Megalin基因的siRNA,通過慢病毒感染成功穫得長期穩定下調人Megalin錶達的腎小管上皮細胞株.
목적:위탐토침묵Megalin기인대신소관상피세포Megalin단백유도표체적억제작용,구건장기하조Megalin단백표체적만병독재체작위연구공구.방법:분별용30,50,80,100 nmol/L siRNA혹대조siRNA전염인HK-2세포,48 h후용면역형광화RT-PCR감정Megalin기인표체사선유효적서렬,용유효혹대조조서렬적정의련화반의련,중간가loop배,량단가입XhoⅠ화hindⅢ적매절위점작위목적서렬,경과XhoⅠ화HindⅢ쌍매절적만병독재체질립PLL3.7작위재체,장목적서렬여재체련접,전화도XL-10Gold고감수태대장간균중,XhoⅠ화HindⅢ쌍매절초보감정,측서진일보감정정학적서렬.득도장기하조인Megalin기인표체적만병독재체,병포장만병독감염인HK-2세포,면역조화감정간우유효,이차획취Megalin표체하조적HK-2세포주.결과여결론:성공사선출유효간우인Megalin기인적siRNA,통과만병독감염성공획득장기은정하조인Megalin표체적신소관상피세포주.
