畜牧与兽医
畜牧與獸醫
축목여수의
ANIMAL HUSBANDRY & VETERINARY MEDICINE
2012年
4期
9-13
,共5页
翁玉根%吉玉辉%孙怀昌%张鑫宇%朱建国%易明梅%袁耀明
翁玉根%吉玉輝%孫懷昌%張鑫宇%硃建國%易明梅%袁耀明
옹옥근%길옥휘%손부창%장흠우%주건국%역명매%원요명
大肠杆菌%卡那霉素抗性基因%重组载体%细胞表达%奶牛
大腸桿菌%卡那黴素抗性基因%重組載體%細胞錶達%奶牛
대장간균%잡나매소항성기인%중조재체%세포표체%내우
为了研究卡那霉素抗性(KanR)基因能否在哺乳动物细胞中表达以及用含相同抗性基因重组质粒防治奶牛乳腺炎的安全性,用PCR从重组质粒p215C3LYZ中扩增得KanR基因,将其克隆入原核表达载体pQE-31,用含卡那霉素(Kan)琼脂平板筛选得KanR重组菌,经IPTG诱导成功表达了预期大小的Kan抗性融合蛋白；用纯化的重组蛋白免疫小鼠,获得了Kan抗性蛋白抗血清,经Western blotting证明免疫血清特异性良好；分别用重组质粒pQE-Kan和p215C3LYZ转染COS-I细胞,在不含抗生素培养液中培养后分别收集细胞上清和细胞裂解物；将转染细胞上清分为添加和不加Kan组,接种Kan敏感菌DH5α大肠杆菌,培养物的OD600检测结果显示,添加组的指示菌生长被抑制,转染细胞上清中无Kan 抗性蛋白表达；以Kan抗性蛋白免疫血清进行的Western blotting结果显示,转染细胞内无Kan抗性蛋白表达；将p215C3LYZ注射奶牛乳腺,用脱脂和浓缩奶样进行Western blotting检测,结果显示试验牛乳中也无Kan抗性蛋白表达.这些试验结果提示,来源于原核大肠杆菌的KanR基因启动子在动物细胞中无转录活性,乳腺注射含KanR基因的重组质粒不会表达对奶牛和人体有害的Kan抗性蛋白.
為瞭研究卡那黴素抗性(KanR)基因能否在哺乳動物細胞中錶達以及用含相同抗性基因重組質粒防治奶牛乳腺炎的安全性,用PCR從重組質粒p215C3LYZ中擴增得KanR基因,將其剋隆入原覈錶達載體pQE-31,用含卡那黴素(Kan)瓊脂平闆篩選得KanR重組菌,經IPTG誘導成功錶達瞭預期大小的Kan抗性融閤蛋白；用純化的重組蛋白免疫小鼠,穫得瞭Kan抗性蛋白抗血清,經Western blotting證明免疫血清特異性良好；分彆用重組質粒pQE-Kan和p215C3LYZ轉染COS-I細胞,在不含抗生素培養液中培養後分彆收集細胞上清和細胞裂解物；將轉染細胞上清分為添加和不加Kan組,接種Kan敏感菌DH5α大腸桿菌,培養物的OD600檢測結果顯示,添加組的指示菌生長被抑製,轉染細胞上清中無Kan 抗性蛋白錶達；以Kan抗性蛋白免疫血清進行的Western blotting結果顯示,轉染細胞內無Kan抗性蛋白錶達；將p215C3LYZ註射奶牛乳腺,用脫脂和濃縮奶樣進行Western blotting檢測,結果顯示試驗牛乳中也無Kan抗性蛋白錶達.這些試驗結果提示,來源于原覈大腸桿菌的KanR基因啟動子在動物細胞中無轉錄活性,乳腺註射含KanR基因的重組質粒不會錶達對奶牛和人體有害的Kan抗性蛋白.
위료연구잡나매소항성(KanR)기인능부재포유동물세포중표체이급용함상동항성기인중조질립방치내우유선염적안전성,용PCR종중조질립p215C3LYZ중확증득KanR기인,장기극륭입원핵표체재체pQE-31,용함잡나매소(Kan)경지평판사선득KanR중조균,경IPTG유도성공표체료예기대소적Kan항성융합단백；용순화적중조단백면역소서,획득료Kan항성단백항혈청,경Western blotting증명면역혈청특이성량호；분별용중조질립pQE-Kan화p215C3LYZ전염COS-I세포,재불함항생소배양액중배양후분별수집세포상청화세포렬해물；장전염세포상청분위첨가화불가Kan조,접충Kan민감균DH5α대장간균,배양물적OD600검측결과현시,첨가조적지시균생장피억제,전염세포상청중무Kan 항성단백표체；이Kan항성단백면역혈청진행적Western blotting결과현시,전염세포내무Kan항성단백표체；장p215C3LYZ주사내우유선,용탈지화농축내양진행Western blotting검측,결과현시시험우유중야무Kan항성단백표체.저사시험결과제시,래원우원핵대장간균적KanR기인계동자재동물세포중무전록활성,유선주사함KanR기인적중조질립불회표체대내우화인체유해적Kan항성단백.
