基础医学与临床
基礎醫學與臨床
기출의학여림상
BASIC MEDICAL SCIENCES AND CLINICS
2012年
2期
226-232
,共7页
RNA干扰%shRNA%腺病毒载体%悬浮细胞
RNA榦擾%shRNA%腺病毒載體%懸浮細胞
RNA간우%shRNA%선병독재체%현부세포
目的 利用重组腺病毒载体携带短发夹RNA (shRNA),使难于转染的悬浮细胞达到较高的目的基因沉默效率.方法 分别将含有人胎盘生长因子(PLGF)的干扰序列及阴性对照序列(scramble)连入pRNAT-H1.1/Adeno载体,获得重组穿梭质粒；将线性化的重组穿梭质粒与腺病毒骨架重组；将重组子转染HEK 293细胞,经过3轮病毒包装,收获病毒颗粒并测定滴度.病毒颗粒感染悬浮细胞——人小细胞肺癌细胞(NCI-H 250和NCI-H 209),通过实时定量PCR方法鉴定靶基因沉默效应,并利用肿瘤细胞重建基质膜侵袭实验进行功能鉴定.结果 成功构建带有靶基因干扰序列及scramble、空载体的3种腺病毒重组子(AD-shuttle-shPLGF、AD-shuttlescramble和AD-shuttle).经过HEK 293细胞包装,最终获得3株病毒颗粒,病毒滴度分别为1.5×1011、1.6×1011和1.6×1011.NCI-H 250和NCI-H 209细胞感染腺病毒颗粒48 h后,大部分细胞表达GFP,感染率接近100％；且两株细胞感染AD-shuttle-shPLGF病毒48 h后,PLGF mRNA表达水平降低(P＜0.01),肿瘤细胞侵袭能力明显下降(P＜0.01).结论 携带shRNA的腺病毒表达载体可以代替电转、脂质体介导等方法,使难于转染细胞的目的基因达到有效沉默.
目的 利用重組腺病毒載體攜帶短髮夾RNA (shRNA),使難于轉染的懸浮細胞達到較高的目的基因沉默效率.方法 分彆將含有人胎盤生長因子(PLGF)的榦擾序列及陰性對照序列(scramble)連入pRNAT-H1.1/Adeno載體,穫得重組穿梭質粒；將線性化的重組穿梭質粒與腺病毒骨架重組；將重組子轉染HEK 293細胞,經過3輪病毒包裝,收穫病毒顆粒併測定滴度.病毒顆粒感染懸浮細胞——人小細胞肺癌細胞(NCI-H 250和NCI-H 209),通過實時定量PCR方法鑒定靶基因沉默效應,併利用腫瘤細胞重建基質膜侵襲實驗進行功能鑒定.結果 成功構建帶有靶基因榦擾序列及scramble、空載體的3種腺病毒重組子(AD-shuttle-shPLGF、AD-shuttlescramble和AD-shuttle).經過HEK 293細胞包裝,最終穫得3株病毒顆粒,病毒滴度分彆為1.5×1011、1.6×1011和1.6×1011.NCI-H 250和NCI-H 209細胞感染腺病毒顆粒48 h後,大部分細胞錶達GFP,感染率接近100％；且兩株細胞感染AD-shuttle-shPLGF病毒48 h後,PLGF mRNA錶達水平降低(P＜0.01),腫瘤細胞侵襲能力明顯下降(P＜0.01).結論 攜帶shRNA的腺病毒錶達載體可以代替電轉、脂質體介導等方法,使難于轉染細胞的目的基因達到有效沉默.
목적 이용중조선병독재체휴대단발협RNA (shRNA),사난우전염적현부세포체도교고적목적기인침묵효솔.방법 분별장함유인태반생장인자(PLGF)적간우서렬급음성대조서렬(scramble)련입pRNAT-H1.1/Adeno재체,획득중조천사질립；장선성화적중조천사질립여선병독골가중조；장중조자전염HEK 293세포,경과3륜병독포장,수획병독과립병측정적도.병독과립감염현부세포——인소세포폐암세포(NCI-H 250화NCI-H 209),통과실시정량PCR방법감정파기인침묵효응,병이용종류세포중건기질막침습실험진행공능감정.결과 성공구건대유파기인간우서렬급scramble、공재체적3충선병독중조자(AD-shuttle-shPLGF、AD-shuttlescramble화AD-shuttle).경과HEK 293세포포장,최종획득3주병독과립,병독적도분별위1.5×1011、1.6×1011화1.6×1011.NCI-H 250화NCI-H 209세포감염선병독과립48 h후,대부분세포표체GFP,감염솔접근100％；차량주세포감염AD-shuttle-shPLGF병독48 h후,PLGF mRNA표체수평강저(P＜0.01),종류세포침습능력명현하강(P＜0.01).결론 휴대shRNA적선병독표체재체가이대체전전、지질체개도등방법,사난우전염세포적목적기인체도유효침묵.
