CAJ | 학술논문

目的:等位基因特异性寡核苷酸杂交是基于分子杂交原理而建立的经典的突变榆测方法,也是DNA芯片技术的重要组成部分,常用于突变筛查.实验拟建立一种适合快速大规模检测心肌肌钙蛋白Ⅰ基因Arg145Trp突变(C4693T)的方法.方法:实验于2002-07/2004-06在南京医科大学第一附属医院心血管病研究所临床生物学诊断与治疗实验室完成.直接测序研究证实的具有cTn Ⅰ基因Arg145Trp突变的肥厚型心肌病患者2例,正常对照1名,受试者对实验均知情同意.自外周血白细胞抽提DNA,聚合酶链反应扩增心肌肌钙蛋白Ⅰ基因含有突变位点的外显子,点于硝纤膜上,分别在不同的温度条件(48,52,56℃)下再与生物素标记的突变及野生探针杂交,摸索最佳杂交条件.根据最佳杂交条件,分别在100倍浓度无关探针条件下行非特异性竞争杂交,在100倍浓度未标记的特异寡核苷酸探针条件下行特异性竞争杂交.结果:采用碱性磷酸酶标记的链霉亲和素和NBT/BCIP观察杂交结果:①突变及野生探针在48℃杂交时,除阴性对照外,2个患者及正常对照样本均见明显阳性信号.②在52℃及56℃条件下突变探针正确榆出两个突变样本,但以56℃结果最佳.③100倍浓度无关探针杂交存在时,对生物素标记的突变寡核苷酸探针杂交结果没有影响,2个患者样本均见明显阳性信号.100倍浓度未标记的突变寡核苷酸探针存在时杂交,完全抑制生物素标记的突变寡核苷酸探针杂交结果.结论:所设计的寡核苷酸探针能够检测出肥厚型心肌病患者心肌肌钙蛋白Ⅰ基因Arg145Trp突变(C4693T),适合该突变的快速大规模筛选.
목적:등위기인특이성과핵감산잡교시기우분자잡교원리이건립적경전적돌변유측방법,야시DNA심편기술적중요조성부분,상용우돌변사사.실험의건립일충괄합쾌속대규모검측심기기개단백Ⅰ기인Arg145Trp돌변(C4693T)적방법.방법:실험우2002-07/2004-06재남경의과대학제일부속의원심혈관병연구소림상생물학진단여치료실험실완성.직접측서연구증실적구유cTn Ⅰ기인Arg145Trp돌변적비후형심기병환자2례,정상대조1명,수시자대실험균지정동의.자외주혈백세포추제DNA,취합매련반응확증심기기개단백Ⅰ기인함유돌변위점적외현자,점우초섬막상,분별재불동적온도조건(48,52,56℃)하재여생물소표기적돌변급야생탐침잡교,모색최가잡교조건.근거최가잡교조건,분별재100배농도무관탐침조건하행비특이성경쟁잡교,재100배농도미표기적특이과핵감산탐침조건하행특이성경쟁잡교.결과:채용감성린산매표기적련매친화소화NBT/BCIP관찰잡교결과:①돌변급야생탐침재48℃잡교시,제음성대조외,2개환자급정상대조양본균견명현양성신호.②재52℃급56℃조건하돌변탐침정학유출량개돌변양본,단이56℃결과최가.③100배농도무관탐침잡교존재시,대생물소표기적돌변과핵감산탐침잡교결과몰유영향,2개환자양본균견명현양성신호.100배농도미표기적돌변과핵감산탐침존재시잡교,완전억제생물소표기적돌변과핵감산탐침잡교결과.결론:소설계적과핵감산탐침능구검측출비후형심기병환자심기기개단백Ⅰ기인Arg145Trp돌변(C4693T),괄합해돌변적쾌속대규모사선.