CAJ | 학술논문

本研究旨在探讨通过构建同时表达大肠杆菌植酸酶appA2及人抗黏液病毒基因A(Myxovirus resistancegene,MxA)的真核表达载体,比较双基因表达载体和相应单基因表达载体中外源基因的表达效率;从pcDNA-ap-pA2载体上扩增CMV-appA2-BGH pA片段,通过Mlu Ⅰ酶切位点连接到pcDNA-MxA载体中,构建重组载体pcDNA-appA-MxA(下称AMP),分别将pcDNA3.1(+)、pcDNA-MxA、pcDNA-appA2及AMP质粒转染猪PK15细胞,经G418筛选后,取细胞通过实时荧光定量PCR测定细胞内appA2及MxA的表达,同时部分细胞通过Western blot测定细胞内MxA蛋白表达量,采用改进的钼酸铵显色法测定细胞内植酸酶活性;酶切及测序结果表明成功构建了AMP载体;QRT-PCR结果表明,转AMP细胞组MxA表达水平是转pcDNA-MxA组的1.118倍,转AMP细胞组appA2表达水平是转pcDNA-appA2组的1.134倍,上述各组间差异显著(P<0.05).灰度分析结果表明,AMP细胞组细胞内MxA表达量是转染pcDNA-MxA细胞组的1.07倍;植酸酶活性测定试验结果表明,转AMP、pcDNA-appA2细胞组及对照组细胞内植酸酶酶活和对照组平均酶活分别为0.294、0.235及0.082FTU·μL-1,2个试验组间差异不显著,试验组和对照组间差异极显著(P<0.01);试验结果表明本研究构建双基因表达载体中外源基凶的表达效率比相应单基因表达载体表达效率高,本研究为以后多基因共表达及制备多基因转基因动物奠定了基础.
본연구지재탐토통과구건동시표체대장간균식산매appA2급인항점액병독기인A(Myxovirus resistancegene,MxA)적진핵표체재체,비교쌍기인표체재체화상응단기인표체재체중외원기인적표체효솔;종pcDNA-ap-pA2재체상확증CMV-appA2-BGH pA편단,통과Mlu Ⅰ매절위점련접도pcDNA-MxA재체중,구건중조재체pcDNA-appA-MxA(하칭AMP),분별장pcDNA3.1(+)、pcDNA-MxA、pcDNA-appA2급AMP질립전염저PK15세포,경G418사선후,취세포통과실시형광정량PCR측정세포내appA2급MxA적표체,동시부분세포통과Western blot측정세포내MxA단백표체량,채용개진적목산안현색법측정세포내식산매활성;매절급측서결과표명성공구건료AMP재체;QRT-PCR결과표명,전AMP세포조MxA표체수평시전pcDNA-MxA조적1.118배,전AMP세포조appA2표체수평시전pcDNA-appA2조적1.134배,상술각조간차이현저(P<0.05).회도분석결과표명,AMP세포조세포내MxA표체량시전염pcDNA-MxA세포조적1.07배;식산매활성측정시험결과표명,전AMP、pcDNA-appA2세포조급대조조세포내식산매매활화대조조평균매활분별위0.294、0.235급0.082FTU·μL-1,2개시험조간차이불현저,시험조화대조조간차이겁현저(P<0.01);시험결과표명본연구구건쌍기인표체재체중외원기흉적표체효솔비상응단기인표체재체표체효솔고,본연구위이후다기인공표체급제비다기인전기인동물전정료기출.