西部医学
西部醫學
서부의학
MEDICAL JOURNAL OF WEST CHINA
2012年
6期
1050-1053
,共4页
陈蕾%曾天芳%周东%李耀华
陳蕾%曾天芳%週東%李耀華
진뢰%증천방%주동%리요화
RNA干扰%HIF-1α%慢病毒
RNA榦擾%HIF-1α%慢病毒
RNA간우%HIF-1α%만병독
目的 构建靶向HIF-1α的RNAi慢病毒载体,为进一步观察其对难治性癫痫大鼠模型脑内HIF-1a基因过度表达的干扰作用奠定基础.方法 根据GenBank报道的大鼠HIF-1α基因序列,选择4个靶序列,设计并合成4对含编码短发夹RNA(shRNA)序列的寡核苷酸,双链退火后,插入经限制性内切酶Age I和EcoR I处理所得的线性化慢病毒载体pGCSIL-GFP(表达绿色荧光蛋白,GFP)的U6启动子下游,合成4种重组病毒pGCSIL-GFP-shRNA1,2,3,4,经酶切和测序鉴定构建正确后,分别与Lipofectamine 2000共转染293T细胞包装,收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液浓缩后得到高滴度的慢病毒液,孔稀释法测定病毒滴度.采用同样方法构建阴性对照重组慢病毒.结果 酶切和测序分析证实成功构建了靶向大鼠HIF-1α的慢病毒表达载体4对,滴度为(5～7)×108 TU/ml.结论 本实验成功构建了针对大鼠HIF- 1α基因的RNAi慢病毒载体,为实现在细胞和动物模型以慢病毒为载体的HIF-1a靶向治疗提供了良好的实验基础.
目的 構建靶嚮HIF-1α的RNAi慢病毒載體,為進一步觀察其對難治性癲癇大鼠模型腦內HIF-1a基因過度錶達的榦擾作用奠定基礎.方法 根據GenBank報道的大鼠HIF-1α基因序列,選擇4箇靶序列,設計併閤成4對含編碼短髮夾RNA(shRNA)序列的寡覈苷痠,雙鏈退火後,插入經限製性內切酶Age I和EcoR I處理所得的線性化慢病毒載體pGCSIL-GFP(錶達綠色熒光蛋白,GFP)的U6啟動子下遊,閤成4種重組病毒pGCSIL-GFP-shRNA1,2,3,4,經酶切和測序鑒定構建正確後,分彆與Lipofectamine 2000共轉染293T細胞包裝,收集富含慢病毒顆粒的細胞上清液濃縮後得到高滴度的慢病毒液,孔稀釋法測定病毒滴度.採用同樣方法構建陰性對照重組慢病毒.結果 酶切和測序分析證實成功構建瞭靶嚮大鼠HIF-1α的慢病毒錶達載體4對,滴度為(5～7)×108 TU/ml.結論 本實驗成功構建瞭針對大鼠HIF- 1α基因的RNAi慢病毒載體,為實現在細胞和動物模型以慢病毒為載體的HIF-1a靶嚮治療提供瞭良好的實驗基礎.
목적 구건파향HIF-1α적RNAi만병독재체,위진일보관찰기대난치성전간대서모형뇌내HIF-1a기인과도표체적간우작용전정기출.방법 근거GenBank보도적대서HIF-1α기인서렬,선택4개파서렬,설계병합성4대함편마단발협RNA(shRNA)서렬적과핵감산,쌍련퇴화후,삽입경한제성내절매Age I화EcoR I처리소득적선성화만병독재체pGCSIL-GFP(표체록색형광단백,GFP)적U6계동자하유,합성4충중조병독pGCSIL-GFP-shRNA1,2,3,4,경매절화측서감정구건정학후,분별여Lipofectamine 2000공전염293T세포포장,수집부함만병독과립적세포상청액농축후득도고적도적만병독액,공희석법측정병독적도.채용동양방법구건음성대조중조만병독.결과 매절화측서분석증실성공구건료파향대서HIF-1α적만병독표체재체4대,적도위(5～7)×108 TU/ml.결론 본실험성공구건료침대대서HIF- 1α기인적RNAi만병독재체,위실현재세포화동물모형이만병독위재체적HIF-1a파향치료제공료량호적실험기출.
