药学实践杂志
藥學實踐雜誌
약학실천잡지
THE JOURNAL OF PHARMACEUTICAL PRACTICE
2011年
2期
97-100
,共4页
核糖体蛋白S3a%原核表达%蛋白纯化%亚细胞定位
覈糖體蛋白S3a%原覈錶達%蛋白純化%亞細胞定位
핵당체단백S3a%원핵표체%단백순화%아세포정위
目的 克隆人核糖体蛋白S3a(Ribosomal protein S3a,RPS3a)基因,并表达、纯化其蛋白,分析RPS3a蛋白的细胞定位,为其功能研究奠定基础.方法 应用RT-PCR从人胚肾HEK293细胞的总RNA中反转录并扩增出RPS3a基因,克隆到原核表达载体PET-21 a中,转化大肠杆菌(Escherichia coil)BL21(DE3)进行蛋白表达.在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导下,PET21a-RPS3a融合表达载体在大肠杆菌菌株BL21(DE3)中以可溶性蛋白的形式高效表达RPS3a蛋白,超声破碎细胞,通过Ni2+-NTA亲和层析柱初步纯化,再应用50 kD超滤膜进一步纯化.用Western Blot印迹实验检测纯化后的蛋白.构建绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP)的pEGFP-N1-RPS3a表达载体,转染HEK293细胞,通过荧光显微镜观察RPS3a重组荧光蛋白在细胞内的分布.结果 获得了较高纯度的RPS3a蛋白,亚细胞定位分析表明RPS3a蛋白主要分布于细胞质.结论 成功克隆了RPS3a基因并表达纯化了其蛋白,确定其亚细胞分布,为进一步研究RPS3a蛋白的性质和功能奠定了基础.
目的 剋隆人覈糖體蛋白S3a(Ribosomal protein S3a,RPS3a)基因,併錶達、純化其蛋白,分析RPS3a蛋白的細胞定位,為其功能研究奠定基礎.方法 應用RT-PCR從人胚腎HEK293細胞的總RNA中反轉錄併擴增齣RPS3a基因,剋隆到原覈錶達載體PET-21 a中,轉化大腸桿菌(Escherichia coil)BL21(DE3)進行蛋白錶達.在異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導下,PET21a-RPS3a融閤錶達載體在大腸桿菌菌株BL21(DE3)中以可溶性蛋白的形式高效錶達RPS3a蛋白,超聲破碎細胞,通過Ni2+-NTA親和層析柱初步純化,再應用50 kD超濾膜進一步純化.用Western Blot印跡實驗檢測純化後的蛋白.構建綠色熒光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP)的pEGFP-N1-RPS3a錶達載體,轉染HEK293細胞,通過熒光顯微鏡觀察RPS3a重組熒光蛋白在細胞內的分佈.結果 穫得瞭較高純度的RPS3a蛋白,亞細胞定位分析錶明RPS3a蛋白主要分佈于細胞質.結論 成功剋隆瞭RPS3a基因併錶達純化瞭其蛋白,確定其亞細胞分佈,為進一步研究RPS3a蛋白的性質和功能奠定瞭基礎.
목적 극륭인핵당체단백S3a(Ribosomal protein S3a,RPS3a)기인,병표체、순화기단백,분석RPS3a단백적세포정위,위기공능연구전정기출.방법 응용RT-PCR종인배신HEK293세포적총RNA중반전록병확증출RPS3a기인,극륭도원핵표체재체PET-21 a중,전화대장간균(Escherichia coil)BL21(DE3)진행단백표체.재이병기류대-β-D-반유당감(IPTG)유도하,PET21a-RPS3a융합표체재체재대장간균균주BL21(DE3)중이가용성단백적형식고효표체RPS3a단백,초성파쇄세포,통과Ni2+-NTA친화층석주초보순화,재응용50 kD초려막진일보순화.용Western Blot인적실험검측순화후적단백.구건록색형광단백(Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP)적pEGFP-N1-RPS3a표체재체,전염HEK293세포,통과형광현미경관찰RPS3a중조형광단백재세포내적분포.결과 획득료교고순도적RPS3a단백,아세포정위분석표명RPS3a단백주요분포우세포질.결론 성공극륭료RPS3a기인병표체순화료기단백,학정기아세포분포,위진일보연구RPS3a단백적성질화공능전정료기출.
