中国医药生物技术
中國醫藥生物技術
중국의약생물기술
CHINESE MEDICINAL BIOTECHNOLOGY
2008年
6期
445-450
,共6页
时辉宁%丁日高%钟玉绪%刘红岩%徐琪寿%马凤中%廖明阳
時輝寧%丁日高%鐘玉緒%劉紅巖%徐琪壽%馬鳳中%廖明暘
시휘저%정일고%종옥서%류홍암%서기수%마봉중%료명양
丝氨酸蛋白酶抑制剂%蛋白质结构,三级%蛋白质工程%克隆,分子
絲氨痠蛋白酶抑製劑%蛋白質結構,三級%蛋白質工程%剋隆,分子
사안산단백매억제제%단백질결구,삼급%단백질공정%극륭,분자
目的 克隆表达人组织因子途径抑制物-2(hTFPI-2)Kunitz结构域1(KD1)基因.方法 提取健康女性正常分娩胎盘中总RNA,采用RT-PCR法合成hTFPI-2全长cDNA后行PCR扩增,以扩增得到的hTFPI-2/KD1基因片段与原核表达载体pET22b进行连接并转化E.coli DH5α,获得重组质粒pET22bhTFPI-2/KD1.将重组质粒pET22b-hTFPI-2/KD1转化至E.coli BL21,获得重组菌株E.coli BL21[pET22b-hTFPI-2/KD1].以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和蛋白质印迹分析,并利用Ni2+-NTA柱进行亲和层析纯化,采用发色底物法和明胶酶谱法分别检测hTFPI-2/KD1抑制胰蛋白酶和基质金属蛋白酶(MMP)的活性.结果 核酸序列测定显示克隆的hTFPI-2/KD1基因序列与理论序列相符.SDS-PAGE和蛋白质印迹分析显示E.coli BL21[pET22b-hTFPI-2/KD1]诱导表达产物相对分子质量与预期相符,经纯化后获得了完整的hTFPI-2/KD1蛋白,发色底物法和明胶酶谱法检测显示其具有抑制胰蛋白酶、MMP-2和MMP-9的活性.结论 通过原核表达系统成功获得高效表达并具有生物活性的hTFPI-2/KD1,为进一步研究其功能奠定了基础.
目的 剋隆錶達人組織因子途徑抑製物-2(hTFPI-2)Kunitz結構域1(KD1)基因.方法 提取健康女性正常分娩胎盤中總RNA,採用RT-PCR法閤成hTFPI-2全長cDNA後行PCR擴增,以擴增得到的hTFPI-2/KD1基因片段與原覈錶達載體pET22b進行連接併轉化E.coli DH5α,穫得重組質粒pET22bhTFPI-2/KD1.將重組質粒pET22b-hTFPI-2/KD1轉化至E.coli BL21,穫得重組菌株E.coli BL21[pET22b-hTFPI-2/KD1].以異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導錶達,對錶達產物進行SDS-PAGE和蛋白質印跡分析,併利用Ni2+-NTA柱進行親和層析純化,採用髮色底物法和明膠酶譜法分彆檢測hTFPI-2/KD1抑製胰蛋白酶和基質金屬蛋白酶(MMP)的活性.結果 覈痠序列測定顯示剋隆的hTFPI-2/KD1基因序列與理論序列相符.SDS-PAGE和蛋白質印跡分析顯示E.coli BL21[pET22b-hTFPI-2/KD1]誘導錶達產物相對分子質量與預期相符,經純化後穫得瞭完整的hTFPI-2/KD1蛋白,髮色底物法和明膠酶譜法檢測顯示其具有抑製胰蛋白酶、MMP-2和MMP-9的活性.結論 通過原覈錶達繫統成功穫得高效錶達併具有生物活性的hTFPI-2/KD1,為進一步研究其功能奠定瞭基礎.
목적 극륭표체인조직인자도경억제물-2(hTFPI-2)Kunitz결구역1(KD1)기인.방법 제취건강녀성정상분면태반중총RNA,채용RT-PCR법합성hTFPI-2전장cDNA후행PCR확증,이확증득도적hTFPI-2/KD1기인편단여원핵표체재체pET22b진행련접병전화E.coli DH5α,획득중조질립pET22bhTFPI-2/KD1.장중조질립pET22b-hTFPI-2/KD1전화지E.coli BL21,획득중조균주E.coli BL21[pET22b-hTFPI-2/KD1].이이병기-β-D-류대반유당감(IPTG)유도표체,대표체산물진행SDS-PAGE화단백질인적분석,병이용Ni2+-NTA주진행친화층석순화,채용발색저물법화명효매보법분별검측hTFPI-2/KD1억제이단백매화기질금속단백매(MMP)적활성.결과 핵산서렬측정현시극륭적hTFPI-2/KD1기인서렬여이론서렬상부.SDS-PAGE화단백질인적분석현시E.coli BL21[pET22b-hTFPI-2/KD1]유도표체산물상대분자질량여예기상부,경순화후획득료완정적hTFPI-2/KD1단백,발색저물법화명효매보법검측현시기구유억제이단백매、MMP-2화MMP-9적활성.결론 통과원핵표체계통성공획득고효표체병구유생물활성적hTFPI-2/KD1,위진일보연구기공능전정료기출.
