中华微生物学和免疫学杂志
中華微生物學和免疫學雜誌
중화미생물학화면역학잡지
CHINESE JOURNAL OF MICROBIOLOGY AND IMMUNOLOGY
2000年
2期
93-97
,共5页
白细胞介素12%逆转录病毒%内核糖体%mIL-2基因
白細胞介素12%逆轉錄病毒%內覈糖體%mIL-2基因
백세포개소12%역전록병독%내핵당체%mIL-2기인
目的 构建含小鼠白细胞介素12双亚基及新霉素磷酸转移酶基因多顺反子逆转录病毒载体,并观察其在小鼠肝癌细胞中的表达.方法 利用脑心肌炎病毒(EMCV)及脊髓灰质炎(Polio)病毒内核糖体进入位点(IRES),连接mIL-12 p40及p35 cDNAs和筛选基因新霉素磷酸转移酶(NeoR),克隆至逆转录病毒载体pGCEN中,使三个基因同时受逆转录病毒载体5′端LTR启动子控制,转录至同一mRNA转录本上,通过不同机制翻译成蛋白质,从而构建成多顺反子逆转录病毒载体,即pGCEN/mIL-12.在LipofectAMINE介导下将pGCEN/mIL-12转染包装细胞PA317,G418筛选,直至出现阳性克隆,挑取抗性克隆,扩大培养,收集上清,用小鼠成纤维细胞NIH3T3测定病毒滴度.然后用重组转录病毒感染小鼠肝癌细胞MM45 T.Li,G418筛选,直至出现抗性克隆,扩大培养,对阳性克隆进行鉴定.结果 由PA317包装细胞产生的重组逆转录病毒的滴度为5×105CFU/ml,将其感染小鼠肝癌细胞MM45 T.Li,后经PCR及Southern blot证明,外源基因已整合至小鼠肝癌细胞基因组中,RT-PCR及Northern blot分析外源基因在mRNA水平上的表达,并证实mIL-12 p40及p35 cDNA和NeoR基因转录在同一mRNA上.ELISA显示mIL-12的表达量48 h为10ng/106细胞.并且M45/mIL-12培养上清能刺激人外周血单个核细胞增殖及诱导小鼠脾细胞IFN-γ的产生(160U/ml).结论 利用IRES构建的含IL-12双亚基多顺反子逆转录病毒载体,能在小鼠肝细胞中稳定有效地表达,从而为利用IL-12进行肿瘤基因治疗奠定了基础.
目的 構建含小鼠白細胞介素12雙亞基及新黴素燐痠轉移酶基因多順反子逆轉錄病毒載體,併觀察其在小鼠肝癌細胞中的錶達.方法 利用腦心肌炎病毒(EMCV)及脊髓灰質炎(Polio)病毒內覈糖體進入位點(IRES),連接mIL-12 p40及p35 cDNAs和篩選基因新黴素燐痠轉移酶(NeoR),剋隆至逆轉錄病毒載體pGCEN中,使三箇基因同時受逆轉錄病毒載體5′耑LTR啟動子控製,轉錄至同一mRNA轉錄本上,通過不同機製翻譯成蛋白質,從而構建成多順反子逆轉錄病毒載體,即pGCEN/mIL-12.在LipofectAMINE介導下將pGCEN/mIL-12轉染包裝細胞PA317,G418篩選,直至齣現暘性剋隆,挑取抗性剋隆,擴大培養,收集上清,用小鼠成纖維細胞NIH3T3測定病毒滴度.然後用重組轉錄病毒感染小鼠肝癌細胞MM45 T.Li,G418篩選,直至齣現抗性剋隆,擴大培養,對暘性剋隆進行鑒定.結果 由PA317包裝細胞產生的重組逆轉錄病毒的滴度為5×105CFU/ml,將其感染小鼠肝癌細胞MM45 T.Li,後經PCR及Southern blot證明,外源基因已整閤至小鼠肝癌細胞基因組中,RT-PCR及Northern blot分析外源基因在mRNA水平上的錶達,併證實mIL-12 p40及p35 cDNA和NeoR基因轉錄在同一mRNA上.ELISA顯示mIL-12的錶達量48 h為10ng/106細胞.併且M45/mIL-12培養上清能刺激人外週血單箇覈細胞增殖及誘導小鼠脾細胞IFN-γ的產生(160U/ml).結論 利用IRES構建的含IL-12雙亞基多順反子逆轉錄病毒載體,能在小鼠肝細胞中穩定有效地錶達,從而為利用IL-12進行腫瘤基因治療奠定瞭基礎.
목적 구건함소서백세포개소12쌍아기급신매소린산전이매기인다순반자역전록병독재체,병관찰기재소서간암세포중적표체.방법 이용뇌심기염병독(EMCV)급척수회질염(Polio)병독내핵당체진입위점(IRES),련접mIL-12 p40급p35 cDNAs화사선기인신매소린산전이매(NeoR),극륭지역전록병독재체pGCEN중,사삼개기인동시수역전록병독재체5′단LTR계동자공제,전록지동일mRNA전록본상,통과불동궤제번역성단백질,종이구건성다순반자역전록병독재체,즉pGCEN/mIL-12.재LipofectAMINE개도하장pGCEN/mIL-12전염포장세포PA317,G418사선,직지출현양성극륭,도취항성극륭,확대배양,수집상청,용소서성섬유세포NIH3T3측정병독적도.연후용중조전록병독감염소서간암세포MM45 T.Li,G418사선,직지출현항성극륭,확대배양,대양성극륭진행감정.결과 유PA317포장세포산생적중조역전록병독적적도위5×105CFU/ml,장기감염소서간암세포MM45 T.Li,후경PCR급Southern blot증명,외원기인이정합지소서간암세포기인조중,RT-PCR급Northern blot분석외원기인재mRNA수평상적표체,병증실mIL-12 p40급p35 cDNA화NeoR기인전록재동일mRNA상.ELISA현시mIL-12적표체량48 h위10ng/106세포.병차M45/mIL-12배양상청능자격인외주혈단개핵세포증식급유도소서비세포IFN-γ적산생(160U/ml).결론 이용IRES구건적함IL-12쌍아기다순반자역전록병독재체,능재소서간세포중은정유효지표체,종이위이용IL-12진행종류기인치료전정료기출.
