临床检验杂志
臨床檢驗雜誌
림상검험잡지
2006年
4期
302-305
,共4页
黄燕%杨文双%徐国宾%夏铁安
黃燕%楊文雙%徐國賓%夏鐵安
황연%양문쌍%서국빈%하철안
人肌酸激酶MM同工酶%校准品%金属螯合亲和层析%稳定性
人肌痠激酶MM同工酶%校準品%金屬螯閤親和層析%穩定性
인기산격매MM동공매%교준품%금속오합친화층석%은정성
目的构建肌酸激酶MM同工酶原核表达系统,纯化重组酶蛋白并对其稳定性进行研究,为其作为参考品或校准品应用于临床奠定基础.方法提取胎儿心肌组织总RNA,反转录扩增人肌酸激酶M亚基基因,构建pET-15b-CK、E.coli BL21(DE3)pLysS原核表达系统,以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达.利用重组蛋白的组氨酸标签(His-tag)进行金属螯合亲和层析纯化,观察重组酶在不同保存条件下的稳定性.结果重组质粒经酶切及测序鉴定与预期相符,诱导表达后细菌裂解液上清酶活性可达280 000 U/L,纯化后SDS-PAGE在分子量45 000处显示单一蛋白条带,在-20 ℃加入70 g/L BSA、1 mmol/L DTT、2 mmol/L EDTA的PBS(pH 7.4)保存体系中,重组酶活性在30 d观察期内基本不变.结论成功表达并纯化了人肌酸激酶MM同工酶,重组酶稳定性良好,初步具备了作为基因工程人源酶校准品的基本特点.
目的構建肌痠激酶MM同工酶原覈錶達繫統,純化重組酶蛋白併對其穩定性進行研究,為其作為參攷品或校準品應用于臨床奠定基礎.方法提取胎兒心肌組織總RNA,反轉錄擴增人肌痠激酶M亞基基因,構建pET-15b-CK、E.coli BL21(DE3)pLysS原覈錶達繫統,以異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導重組蛋白錶達.利用重組蛋白的組氨痠標籤(His-tag)進行金屬螯閤親和層析純化,觀察重組酶在不同保存條件下的穩定性.結果重組質粒經酶切及測序鑒定與預期相符,誘導錶達後細菌裂解液上清酶活性可達280 000 U/L,純化後SDS-PAGE在分子量45 000處顯示單一蛋白條帶,在-20 ℃加入70 g/L BSA、1 mmol/L DTT、2 mmol/L EDTA的PBS(pH 7.4)保存體繫中,重組酶活性在30 d觀察期內基本不變.結論成功錶達併純化瞭人肌痠激酶MM同工酶,重組酶穩定性良好,初步具備瞭作為基因工程人源酶校準品的基本特點.
목적구건기산격매MM동공매원핵표체계통,순화중조매단백병대기은정성진행연구,위기작위삼고품혹교준품응용우림상전정기출.방법제취태인심기조직총RNA,반전록확증인기산격매M아기기인,구건pET-15b-CK、E.coli BL21(DE3)pLysS원핵표체계통,이이병기-β-D-류대반유당감(IPTG)유도중조단백표체.이용중조단백적조안산표첨(His-tag)진행금속오합친화층석순화,관찰중조매재불동보존조건하적은정성.결과중조질립경매절급측서감정여예기상부,유도표체후세균렬해액상청매활성가체280 000 U/L,순화후SDS-PAGE재분자량45 000처현시단일단백조대,재-20 ℃가입70 g/L BSA、1 mmol/L DTT、2 mmol/L EDTA적PBS(pH 7.4)보존체계중,중조매활성재30 d관찰기내기본불변.결론성공표체병순화료인기산격매MM동공매,중조매은정성량호,초보구비료작위기인공정인원매교준품적기본특점.
