CAJ | 학술논문

背景:移植物主要组织相容性抗原复合物在移植排斥反应中起关键作用.用慢病毒介导的人类白细胞抗原RNA干扰技术可以降低T淋巴细胞的细胞毒作用和抗体介导的溶细胞作用,但尚未见相关体内研究报道.目的:拟用携带人类白细胞抗原A小分子干扰RNA序列的慢病毒感染人胚肺成纤维细胞,再将其移植到帕金森大鼠纹状体,观察人类白细胞抗原A表达沉默对移植排斥反应的调节.设计、时间及地点:细胞基因工程体内实验,于2005-09/2008-01在首都医科大学神经科学研究所完成.材料:清洁级12周龄雌性SD大鼠33只,用于建立帕金森动物模型.原代培养的人胚肺成纤维细胞取材于12周流产人胚胎,由北京京北医院提供.293T为贴壁依赖型成上皮样细胞.慢病毒载体系统由pSicoR,pCMV-VSV-G和psPAX2三质粒组成,为美国Addgene公司产品.携带HLA-A2 cDNA的pcDNA I/Amp-HLA质粒由比利时Ludwig肿瘤研究所Pierre van Bruggen教授惠赠.方法:以携带HLA-A2 cDNA的pcDNA I/Amp-HLA质粒为模板PCR扩增HLA-A2 cDNA编码区序列,构建人类白细胞抗原A融合蛋白表达载体pEGFP-Flag-HLA,转染293T细胞.用HLA-A2编码区序列设计小分子干扰RNA 4个待选靶点序列,分别起始于编码区的第257,350,833,251位碱基,构建表达小分子干扰RNA慢病毒载体.用带有Flag标签的人类白细胞抗原A cDNA表达载体转染293T细胞后,再进行不同靶点病毒直接感染.33只帕金森模型大鼠随机分为2组,实验组大鼠纹状体植入人类白细胞抗原A小分子干扰RNA病毒感染的人胚肺成纤维细胞,对照组植入带有小分子干扰RNA对照序列和绿色荧光蛋白病毒感染的人胚肺成纤维细胞.主要观察指标:免疫组织化学染色检测脑内移植物人类白细胞抗原A、CD4和CD8的表达,用抗人细胞核的阳性表达评价移植细胞的存活情况.结果:与对照组比较,实验组移植后4d、2周时人类白细胞抗原A阳性细胞均较少(t=3.301,2.63l,P<0.01,0.05),6周时无明显变化:CD4阳性细胞仪移植后6周明显减少(t=2.269,P<0.05):移植后4 dCD8阳性细胞无明显变化,2周及6周时明显减少(t=2.333,P<0.05);抗人细胞核阳性细胞仅移植后2周明显减少(t=2.952,P<0.05).结论:人类白细胞抗原A表达敲减可以抑制移植排斥反应,但并不能显著延长移植物的存活时间. 揹景:移植物主要組織相容性抗原複閤物在移植排斥反應中起關鍵作用.用慢病毒介導的人類白細胞抗原RNA榦擾技術可以降低T淋巴細胞的細胞毒作用和抗體介導的溶細胞作用,但尚未見相關體內研究報道.目的:擬用攜帶人類白細胞抗原A小分子榦擾RNA序列的慢病毒感染人胚肺成纖維細胞,再將其移植到帕金森大鼠紋狀體,觀察人類白細胞抗原A錶達沉默對移植排斥反應的調節.設計、時間及地點:細胞基因工程體內實驗,于2005-09/2008-01在首都醫科大學神經科學研究所完成.材料:清潔級12週齡雌性SD大鼠33隻,用于建立帕金森動物模型.原代培養的人胚肺成纖維細胞取材于12週流產人胚胎,由北京京北醫院提供.293T為貼壁依賴型成上皮樣細胞.慢病毒載體繫統由pSicoR,pCMV-VSV-G和psPAX2三質粒組成,為美國Addgene公司產品.攜帶HLA-A2 cDNA的pcDNA I/Amp-HLA質粒由比利時Ludwig腫瘤研究所Pierre van Bruggen教授惠贈.方法:以攜帶HLA-A2 cDNA的pcDNA I/Amp-HLA質粒為模闆PCR擴增HLA-A2 cDNA編碼區序列,構建人類白細胞抗原A融閤蛋白錶達載體pEGFP-Flag-HLA,轉染293T細胞.用HLA-A2編碼區序列設計小分子榦擾RNA 4箇待選靶點序列,分彆起始于編碼區的第257,350,833,251位堿基,構建錶達小分子榦擾RNA慢病毒載體.用帶有Flag標籤的人類白細胞抗原A cDNA錶達載體轉染293T細胞後,再進行不同靶點病毒直接感染.33隻帕金森模型大鼠隨機分為2組,實驗組大鼠紋狀體植入人類白細胞抗原A小分子榦擾RNA病毒感染的人胚肺成纖維細胞,對照組植入帶有小分子榦擾RNA對照序列和綠色熒光蛋白病毒感染的人胚肺成纖維細胞.主要觀察指標:免疫組織化學染色檢測腦內移植物人類白細胞抗原A、CD4和CD8的錶達,用抗人細胞覈的暘性錶達評價移植細胞的存活情況.結果:與對照組比較,實驗組移植後4d、2週時人類白細胞抗原A暘性細胞均較少(t=3.301,2.63l,P<0.01,0.05),6週時無明顯變化:CD4暘性細胞儀移植後6週明顯減少(t=2.269,P<0.05):移植後4 dCD8暘性細胞無明顯變化,2週及6週時明顯減少(t=2.333,P<0.05);抗人細胞覈暘性細胞僅移植後2週明顯減少(t=2.952,P<0.05).結論:人類白細胞抗原A錶達敲減可以抑製移植排斥反應,但併不能顯著延長移植物的存活時間.
배경:이식물주요조직상용성항원복합물재이식배척반응중기관건작용.용만병독개도적인류백세포항원RNA간우기술가이강저T림파세포적세포독작용화항체개도적용세포작용,단상미견상관체내연구보도.목적:의용휴대인류백세포항원A소분자간우RNA서렬적만병독감염인배폐성섬유세포,재장기이식도파금삼대서문상체,관찰인류백세포항원A표체침묵대이식배척반응적조절.설계、시간급지점:세포기인공정체내실험,우2005-09/2008-01재수도의과대학신경과학연구소완성.재료:청길급12주령자성SD대서33지,용우건립파금삼동물모형.원대배양적인배폐성섬유세포취재우12주유산인배태,유북경경북의원제공.293T위첩벽의뢰형성상피양세포.만병독재체계통유pSicoR,pCMV-VSV-G화psPAX2삼질립조성,위미국Addgene공사산품.휴대HLA-A2 cDNA적pcDNA I/Amp-HLA질립유비리시Ludwig종류연구소Pierre van Bruggen교수혜증.방법:이휴대HLA-A2 cDNA적pcDNA I/Amp-HLA질립위모판PCR확증HLA-A2 cDNA편마구서렬,구건인류백세포항원A융합단백표체재체pEGFP-Flag-HLA,전염293T세포.용HLA-A2편마구서렬설계소분자간우RNA 4개대선파점서렬,분별기시우편마구적제257,350,833,251위감기,구건표체소분자간우RNA만병독재체.용대유Flag표첨적인류백세포항원A cDNA표체재체전염293T세포후,재진행불동파점병독직접감염.33지파금삼모형대서수궤분위2조,실험조대서문상체식입인류백세포항원A소분자간우RNA병독감염적인배폐성섬유세포,대조조식입대유소분자간우RNA대조서렬화록색형광단백병독감염적인배폐성섬유세포.주요관찰지표:면역조직화학염색검측뇌내이식물인류백세포항원A、CD4화CD8적표체,용항인세포핵적양성표체평개이식세포적존활정황.결과:여대조조비교,실험조이식후4d、2주시인류백세포항원A양성세포균교소(t=3.301,2.63l,P<0.01,0.05),6주시무명현변화:CD4양성세포의이식후6주명현감소(t=2.269,P<0.05):이식후4 dCD8양성세포무명현변화,2주급6주시명현감소(t=2.333,P<0.05);항인세포핵양성세포부이식후2주명현감소(t=2.952,P<0.05).결론:인류백세포항원A표체고감가이억제이식배척반응,단병불능현저연장이식물적존활시간.