CAJ | 학술논문

目的:构建血管生成抑制因子人内皮抑素非融合蛋白大肠杆菌表达载体.方法:实验于2004-02/12在中山大学生命科学院医药分子生物学实验室完成,表达质粒由中山大学医药分子实验室保存,肝细胞来源于南方医科大学珠江医院引产胎儿肝脏.用反转录多聚合酶链反应得到人内皮抑素全基因,连接PGEM-T载体,在16℃下以进行16 h连接反应,转化大肠杆菌DH5α,对所获克隆扩大培养,提取质粒经EcoRI,BamHI酶切鉴定.将带有插入片段的重组质粒命名为PGEM-Tendo.对其阳性克隆扩大培养,大量提取质粒,以T7,SP6为测序引物进行全自动正、反向测序确认.将PGEM-Tendo质粒及表达载体pBV220经EcoR I,BamHI酶切后定向连接,转化入大肠杆菌DH5α,聚合酶链反应鉴定阳性克隆,命名为pBV220-endo.将含pBV220-endo的DH5α工程菌在30℃小量培养,经42℃热诱导4 h后收菌,对所收菌和诱导前细菌进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶.离心收集菌体并超声破碎,将超声后的上清液和沉淀进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析.结果:反转录-聚合酶链反应获得内皮抑素基因含酶切位点约573 bP,用EcoRI,BamH I双酶切,10 g/L琼脂糖凝胶电泳上可见约为552 bp的内皮抑素片段和约为3 000 bp的PGEM-T载体片段,说明内皮抑素已成功构建在PGEM-T载体上.经全自动正、反向测序,Genbank分析证实,所获得的552 bp基因片段序列属于人内皮抑素功能区段基因,该基因的第471位氨基酸编码碱基由G突变为A,但编码的氨基酸都是精氨酸,经十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,出现特异性蛋白质.条带,大小与人内皮抑素蛋白大小相符合.非融合重组蛋白内皮抑素主要以不溶的包涵体形式表达,表达量为14.5%.结论:克隆的552 bp的内皮抑素基因,经与GenBank中人胶原ⅩⅧcDNA中内皮抑素基因比较,基因序列基本一致,说明人内皮抑素基因在大肠杆菌中获得非融合表达,为应用内皮抑素进行抗血管生成基因治疗奠定了实验方法学基础. 目的:構建血管生成抑製因子人內皮抑素非融閤蛋白大腸桿菌錶達載體.方法:實驗于2004-02/12在中山大學生命科學院醫藥分子生物學實驗室完成,錶達質粒由中山大學醫藥分子實驗室保存,肝細胞來源于南方醫科大學珠江醫院引產胎兒肝髒.用反轉錄多聚閤酶鏈反應得到人內皮抑素全基因,連接PGEM-T載體,在16℃下以進行16 h連接反應,轉化大腸桿菌DH5α,對所穫剋隆擴大培養,提取質粒經EcoRI,BamHI酶切鑒定.將帶有插入片段的重組質粒命名為PGEM-Tendo.對其暘性剋隆擴大培養,大量提取質粒,以T7,SP6為測序引物進行全自動正、反嚮測序確認.將PGEM-Tendo質粒及錶達載體pBV220經EcoR I,BamHI酶切後定嚮連接,轉化入大腸桿菌DH5α,聚閤酶鏈反應鑒定暘性剋隆,命名為pBV220-endo.將含pBV220-endo的DH5α工程菌在30℃小量培養,經42℃熱誘導4 h後收菌,對所收菌和誘導前細菌進行十二烷基磺痠鈉-聚丙烯酰胺凝膠.離心收集菌體併超聲破碎,將超聲後的上清液和沉澱進行十二烷基磺痠鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析.結果:反轉錄-聚閤酶鏈反應穫得內皮抑素基因含酶切位點約573 bP,用EcoRI,BamH I雙酶切,10 g/L瓊脂糖凝膠電泳上可見約為552 bp的內皮抑素片段和約為3 000 bp的PGEM-T載體片段,說明內皮抑素已成功構建在PGEM-T載體上.經全自動正、反嚮測序,Genbank分析證實,所穫得的552 bp基因片段序列屬于人內皮抑素功能區段基因,該基因的第471位氨基痠編碼堿基由G突變為A,但編碼的氨基痠都是精氨痠,經十二烷基磺痠鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分析,齣現特異性蛋白質.條帶,大小與人內皮抑素蛋白大小相符閤.非融閤重組蛋白內皮抑素主要以不溶的包涵體形式錶達,錶達量為14.5%.結論:剋隆的552 bp的內皮抑素基因,經與GenBank中人膠原ⅩⅧcDNA中內皮抑素基因比較,基因序列基本一緻,說明人內皮抑素基因在大腸桿菌中穫得非融閤錶達,為應用內皮抑素進行抗血管生成基因治療奠定瞭實驗方法學基礎.
목적:구건혈관생성억제인자인내피억소비융합단백대장간균표체재체.방법:실험우2004-02/12재중산대학생명과학원의약분자생물학실험실완성,표체질립유중산대학의약분자실험실보존,간세포래원우남방의과대학주강의원인산태인간장.용반전록다취합매련반응득도인내피억소전기인,련접PGEM-T재체,재16℃하이진행16 h련접반응,전화대장간균DH5α,대소획극륭확대배양,제취질립경EcoRI,BamHI매절감정.장대유삽입편단적중조질립명명위PGEM-Tendo.대기양성극륭확대배양,대량제취질립,이T7,SP6위측서인물진행전자동정、반향측서학인.장PGEM-Tendo질립급표체재체pBV220경EcoR I,BamHI매절후정향련접,전화입대장간균DH5α,취합매련반응감정양성극륭,명명위pBV220-endo.장함pBV220-endo적DH5α공정균재30℃소량배양,경42℃열유도4 h후수균,대소수균화유도전세균진행십이완기광산납-취병희선알응효.리심수집균체병초성파쇄,장초성후적상청액화침정진행십이완기광산납-취병희선알응효전영분석.결과:반전록-취합매련반응획득내피억소기인함매절위점약573 bP,용EcoRI,BamH I쌍매절,10 g/L경지당응효전영상가견약위552 bp적내피억소편단화약위3 000 bp적PGEM-T재체편단,설명내피억소이성공구건재PGEM-T재체상.경전자동정、반향측서,Genbank분석증실,소획득적552 bp기인편단서렬속우인내피억소공능구단기인,해기인적제471위안기산편마감기유G돌변위A,단편마적안기산도시정안산,경십이완기광산납취병희선알응효전영분석,출현특이성단백질.조대,대소여인내피억소단백대소상부합.비융합중조단백내피억소주요이불용적포함체형식표체,표체량위14.5%.결론:극륭적552 bp적내피억소기인,경여GenBank중인효원ⅩⅧcDNA중내피억소기인비교,기인서렬기본일치,설명인내피억소기인재대장간균중획득비융합표체,위응용내피억소진행항혈관생성기인치료전정료실험방법학기출.