生物工程学报
生物工程學報
생물공정학보
CHINESE JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY
2006年
5期
789-794
,共6页
薛利军%王永智%任浩%童一民%赵平%朱诗应%戚中田
薛利軍%王永智%任浩%童一民%趙平%硃詩應%慼中田
설리군%왕영지%임호%동일민%조평%주시응%척중전
铜绿假单胞菌%16S rDNA%荧光定量PCR%检测
銅綠假單胞菌%16S rDNA%熒光定量PCR%檢測
동록가단포균%16S rDNA%형광정량PCR%검측
对20余种细菌16S rDNAs进行多序列比对与进化树分析,设计铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)荧光定量PCR(fluorescence quantitative PCR,FQ-PCR)特异性引物.提取PA基因组DNA,以特异性引物扩增16S rDNA靶片段,并构建重组质粒pMDT-Pfr.将梯度稀释的pMD-Pfr质粒作为模板,用于建立定量标准曲线.以SYBR Green Ⅰ荧光染料建立20μL反应体系,对不同浓度的PA DNA样品进行FQ-PCR检测.同时,以金黄色葡萄球菌、伤寒杆菌、福氏志贺菌、变形杆菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌和结核杆菌的基因组DNA作阴性对照,验证FQ-PCR方法检测PA的特异性.结果显示,设计的FQ-PCR引物的靶向序列,仅对PA 16SrDNA有高度同源性;FQ-PCR方法检测PA,其灵敏度达3.6pg/μL的基因组DNA或(2.1×103±3.1×102)拷贝/μL的16SrDNA基因,并且具有很强的特异性;从细菌DNA提取到FQ-PCR检测,可在2h左右完成PA鉴定.较传统的培养鉴定法而言,以16S rDNA作为FQ-PCR靶基因快速检测PA,具有很好的研究价值与应用前景.
對20餘種細菌16S rDNAs進行多序列比對與進化樹分析,設計銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)熒光定量PCR(fluorescence quantitative PCR,FQ-PCR)特異性引物.提取PA基因組DNA,以特異性引物擴增16S rDNA靶片段,併構建重組質粒pMDT-Pfr.將梯度稀釋的pMD-Pfr質粒作為模闆,用于建立定量標準麯線.以SYBR Green Ⅰ熒光染料建立20μL反應體繫,對不同濃度的PA DNA樣品進行FQ-PCR檢測.同時,以金黃色葡萄毬菌、傷寒桿菌、福氏誌賀菌、變形桿菌、錶皮葡萄毬菌、大腸桿菌和結覈桿菌的基因組DNA作陰性對照,驗證FQ-PCR方法檢測PA的特異性.結果顯示,設計的FQ-PCR引物的靶嚮序列,僅對PA 16SrDNA有高度同源性;FQ-PCR方法檢測PA,其靈敏度達3.6pg/μL的基因組DNA或(2.1×103±3.1×102)拷貝/μL的16SrDNA基因,併且具有很彊的特異性;從細菌DNA提取到FQ-PCR檢測,可在2h左右完成PA鑒定.較傳統的培養鑒定法而言,以16S rDNA作為FQ-PCR靶基因快速檢測PA,具有很好的研究價值與應用前景.
대20여충세균16S rDNAs진행다서렬비대여진화수분석,설계동록가단포균(Pseudomonas aeruginosa,PA)형광정량PCR(fluorescence quantitative PCR,FQ-PCR)특이성인물.제취PA기인조DNA,이특이성인물확증16S rDNA파편단,병구건중조질립pMDT-Pfr.장제도희석적pMD-Pfr질립작위모판,용우건립정량표준곡선.이SYBR Green Ⅰ형광염료건립20μL반응체계,대불동농도적PA DNA양품진행FQ-PCR검측.동시,이금황색포도구균、상한간균、복씨지하균、변형간균、표피포도구균、대장간균화결핵간균적기인조DNA작음성대조,험증FQ-PCR방법검측PA적특이성.결과현시,설계적FQ-PCR인물적파향서렬,부대PA 16SrDNA유고도동원성;FQ-PCR방법검측PA,기령민도체3.6pg/μL적기인조DNA혹(2.1×103±3.1×102)고패/μL적16SrDNA기인,병차구유흔강적특이성;종세균DNA제취도FQ-PCR검측,가재2h좌우완성PA감정.교전통적배양감정법이언,이16S rDNA작위FQ-PCR파기인쾌속검측PA,구유흔호적연구개치여응용전경.
