医学分子生物学杂志
醫學分子生物學雜誌
의학분자생물학잡지
FOREIGN MEDICAL SCIENCES
2011年
5期
400-404
,共5页
赵元茵%柳鹏%王元忠%张艳%娄桂予%何凤田%李渝萍
趙元茵%柳鵬%王元忠%張豔%婁桂予%何鳳田%李渝萍
조원인%류붕%왕원충%장염%루계여%하봉전%리투평
核蛋白%核定位信号%绿色荧光蛋白%谷胱甘肽转硫酶
覈蛋白%覈定位信號%綠色熒光蛋白%穀胱甘肽轉硫酶
핵단백%핵정위신호%록색형광단백%곡광감태전류매
目的 构建谷胱甘肽转硫酶(GST)与EGFP相融合的新型蛋白质示踪载体--pGST-EGFP,以用于蛋白质细胞亚定位信号序列的深入分析.方法 以质粒pEGFP-N1为骨架,融合从pGEX-2TK载体中扩增的GST编码序列,构建成pGST-EGFP融合表达质粒;再插入人工合成的已知核定位蛋白SV40的核定位序列(NLS),构建成pGST-EGFP-SV40 NLS作为阳性对照;另外,构建小分子量蛋白TNNI2在pGST-EGFP的融合表达质粒.将对照pEGFP-N1和各重组质粒分别用脂质体介导,瞬时转染HeLa细胞,荧光显微镜下观察蛋白的核定位情况.结果 单独表达的EGFP呈全细胞分布,而GST-EGFP融合蛋白只存在于细胞浆;SV40 NLS能将GST-EGFP融合蛋白带进细胞核.虽然TNNI2-EGFP融合蛋白的细胞亚定位呈现核内丰度更高的特点,但TNNI2-GST-EGFP融合蛋白仅限定于胞浆分布,提示TNNI2不能主动定位到细胞核中.结论 成功构建了蛋白质细胞亚定位示踪载体--pGST-EGFP.作为核定位信号分析系统,其对小分子蛋白细胞亚定位的示踪效果优于传统的pEGFP载体,更适用于科研工作中小分子量蛋白质核定位信号序列的研究.
目的 構建穀胱甘肽轉硫酶(GST)與EGFP相融閤的新型蛋白質示蹤載體--pGST-EGFP,以用于蛋白質細胞亞定位信號序列的深入分析.方法 以質粒pEGFP-N1為骨架,融閤從pGEX-2TK載體中擴增的GST編碼序列,構建成pGST-EGFP融閤錶達質粒;再插入人工閤成的已知覈定位蛋白SV40的覈定位序列(NLS),構建成pGST-EGFP-SV40 NLS作為暘性對照;另外,構建小分子量蛋白TNNI2在pGST-EGFP的融閤錶達質粒.將對照pEGFP-N1和各重組質粒分彆用脂質體介導,瞬時轉染HeLa細胞,熒光顯微鏡下觀察蛋白的覈定位情況.結果 單獨錶達的EGFP呈全細胞分佈,而GST-EGFP融閤蛋白隻存在于細胞漿;SV40 NLS能將GST-EGFP融閤蛋白帶進細胞覈.雖然TNNI2-EGFP融閤蛋白的細胞亞定位呈現覈內豐度更高的特點,但TNNI2-GST-EGFP融閤蛋白僅限定于胞漿分佈,提示TNNI2不能主動定位到細胞覈中.結論 成功構建瞭蛋白質細胞亞定位示蹤載體--pGST-EGFP.作為覈定位信號分析繫統,其對小分子蛋白細胞亞定位的示蹤效果優于傳統的pEGFP載體,更適用于科研工作中小分子量蛋白質覈定位信號序列的研究.
목적 구건곡광감태전류매(GST)여EGFP상융합적신형단백질시종재체--pGST-EGFP,이용우단백질세포아정위신호서렬적심입분석.방법 이질립pEGFP-N1위골가,융합종pGEX-2TK재체중확증적GST편마서렬,구건성pGST-EGFP융합표체질립;재삽입인공합성적이지핵정위단백SV40적핵정위서렬(NLS),구건성pGST-EGFP-SV40 NLS작위양성대조;령외,구건소분자량단백TNNI2재pGST-EGFP적융합표체질립.장대조pEGFP-N1화각중조질립분별용지질체개도,순시전염HeLa세포,형광현미경하관찰단백적핵정위정황.결과 단독표체적EGFP정전세포분포,이GST-EGFP융합단백지존재우세포장;SV40 NLS능장GST-EGFP융합단백대진세포핵.수연TNNI2-EGFP융합단백적세포아정위정현핵내봉도경고적특점,단TNNI2-GST-EGFP융합단백부한정우포장분포,제시TNNI2불능주동정위도세포핵중.결론 성공구건료단백질세포아정위시종재체--pGST-EGFP.작위핵정위신호분석계통,기대소분자단백세포아정위적시종효과우우전통적pEGFP재체,경괄용우과연공작중소분자량단백질핵정위신호서렬적연구.
