生物技术通报
生物技術通報
생물기술통보
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
2011年
6期
127-133
,共7页
郭艳荣%常晓月%崔晓君%魏勋斌%朱乃硕
郭豔榮%常曉月%崔曉君%魏勛斌%硃迺碩
곽염영%상효월%최효군%위훈빈%주내석
eEF1A1%基因克隆%分泌表达%融合蛋白%蛋白纯化
eEF1A1%基因剋隆%分泌錶達%融閤蛋白%蛋白純化
eEF1A1%기인극륭%분비표체%융합단백%단백순화
eEF1A1作为蛋白合成中的重要翻译延伸因子,可与多种功能性蛋白如F-actin、BPOZ-2结合,并在细胞凋亡、蛋白降解方面起重要作用.以往原核基因工程蛋白表达系统大多为包涵体表达的变性分子,需要复性.为了获得eEF1A1原核分泌性可溶性蛋白分子,克隆了人eEF1A1蛋白编码序列(约1 300 bp),并成功构建pET22b-A原核分泌表达重组质粒,转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株,0.4 mmol/L终浓度IPTG诱导,经不同温度下包涵体与胞浆蛋白组分分析,快速明确蛋白表达情况,即诱导4 h后,37℃表达于包涵体组分,在30℃分泌表达至胞浆组分.通过His-Trap亲和层析纯化柱进行线性洗脱,Bradford法测定蛋白浓度高达620 mg/mL,SDS-PAGE分析纯度约为95%,蛋白大小符合50 kD,Western blotting显示目的蛋白能被eEF1A1抗体识别;质谱分析证实重组蛋白为人eEF1A1蛋白分子.为进一步研究其与重要功能性蛋白的相互作用及在细胞凋亡和蛋白降解中的作用奠定基础.
eEF1A1作為蛋白閤成中的重要翻譯延伸因子,可與多種功能性蛋白如F-actin、BPOZ-2結閤,併在細胞凋亡、蛋白降解方麵起重要作用.以往原覈基因工程蛋白錶達繫統大多為包涵體錶達的變性分子,需要複性.為瞭穫得eEF1A1原覈分泌性可溶性蛋白分子,剋隆瞭人eEF1A1蛋白編碼序列(約1 300 bp),併成功構建pET22b-A原覈分泌錶達重組質粒,轉化到大腸桿菌BL21(DE3)菌株,0.4 mmol/L終濃度IPTG誘導,經不同溫度下包涵體與胞漿蛋白組分分析,快速明確蛋白錶達情況,即誘導4 h後,37℃錶達于包涵體組分,在30℃分泌錶達至胞漿組分.通過His-Trap親和層析純化柱進行線性洗脫,Bradford法測定蛋白濃度高達620 mg/mL,SDS-PAGE分析純度約為95%,蛋白大小符閤50 kD,Western blotting顯示目的蛋白能被eEF1A1抗體識彆;質譜分析證實重組蛋白為人eEF1A1蛋白分子.為進一步研究其與重要功能性蛋白的相互作用及在細胞凋亡和蛋白降解中的作用奠定基礎.
eEF1A1작위단백합성중적중요번역연신인자,가여다충공능성단백여F-actin、BPOZ-2결합,병재세포조망、단백강해방면기중요작용.이왕원핵기인공정단백표체계통대다위포함체표체적변성분자,수요복성.위료획득eEF1A1원핵분비성가용성단백분자,극륭료인eEF1A1단백편마서렬(약1 300 bp),병성공구건pET22b-A원핵분비표체중조질립,전화도대장간균BL21(DE3)균주,0.4 mmol/L종농도IPTG유도,경불동온도하포함체여포장단백조분분석,쾌속명학단백표체정황,즉유도4 h후,37℃표체우포함체조분,재30℃분비표체지포장조분.통과His-Trap친화층석순화주진행선성세탈,Bradford법측정단백농도고체620 mg/mL,SDS-PAGE분석순도약위95%,단백대소부합50 kD,Western blotting현시목적단백능피eEF1A1항체식별;질보분석증실중조단백위인eEF1A1단백분자.위진일보연구기여중요공능성단백적상호작용급재세포조망화단백강해중적작용전정기출.
