华中科技大学学报（医学版）
華中科技大學學報（醫學版）
화중과기대학학보（의학판）
ACTA UNIVERSITATIS MEDICINAE TONGJI
2012年
3期
329-332,352
,共5页
逄坤芳%陈鹤翔%杨辉%卜慧莲%刘希江
逄坤芳%陳鶴翔%楊輝%蔔慧蓮%劉希江
방곤방%진학상%양휘%복혜련%류희강
δ阿片受体%人前脑啡肽原基因%RNA干扰%慢病毒%吗啡耐受
δ阿片受體%人前腦啡肽原基因%RNA榦擾%慢病毒%嗎啡耐受
δ아편수체%인전뇌배태원기인%RNA간우%만병독%마배내수
目的 构建大鼠δ阿片受体(delta opioid receptor,DOR)基因小发卡RNA(shRNA)及人前脑啡肽原基因(human preproenkephalin gene,hPPE)双表达慢病毒载体并鉴定.方法 根据大鼠DOR mRNA序列设计shRNA并合成包含正、反义靶序列的互补DNA链,退火后插入至shRNA表达载体pENTR/U6 vector中,构建shRNA表达质粒,并转化至感受态细胞DH5α,抽提质粒后进行测序.合成hPPE基因序列并插入到表达载体pcDNA3.1(+)中,转化至感受态细胞DH5α,挑取多个单克隆进行测序验证.将hPPE插入已构建成功的pENTR/U6-shRNA载体中,再与慢病毒载体pLenti7.3/V5-DEST重组,构建慢病毒载体pLenti-CMV-hPPE-U6-shRNA并转化DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆并测序验证,保留测序验证正确的LR重组质粒.用构建的慢病毒表达载体pLenti-CMV-hPPE-U6-shRNA和包装质粒共转染293T细胞,包装病毒,并测定滴度.结果经测序验证重组质粒pENTR/U6-shRNA、pcDNA3.1(+)-hPPE和慢病毒载体pLenti-CMV-hPPE-U6-shRNA均构建成功.大鼠δ阿片受体基因小发卡RNA及人前脑啡肽原基因双表达慢病毒包装成功,病毒滴度为1×107 TU/mL.结论大鼠DOR基因小发卡RNA及人前脑啡肽原基因双表达慢病毒载体构建成功,为研究DOR和hPPE在吗啡耐受中的作用机制及探求更加合理的镇痛方式奠定了基础.
目的 構建大鼠δ阿片受體(delta opioid receptor,DOR)基因小髮卡RNA(shRNA)及人前腦啡肽原基因(human preproenkephalin gene,hPPE)雙錶達慢病毒載體併鑒定.方法 根據大鼠DOR mRNA序列設計shRNA併閤成包含正、反義靶序列的互補DNA鏈,退火後插入至shRNA錶達載體pENTR/U6 vector中,構建shRNA錶達質粒,併轉化至感受態細胞DH5α,抽提質粒後進行測序.閤成hPPE基因序列併插入到錶達載體pcDNA3.1(+)中,轉化至感受態細胞DH5α,挑取多箇單剋隆進行測序驗證.將hPPE插入已構建成功的pENTR/U6-shRNA載體中,再與慢病毒載體pLenti7.3/V5-DEST重組,構建慢病毒載體pLenti-CMV-hPPE-U6-shRNA併轉化DH5α感受態細胞,篩選暘性剋隆併測序驗證,保留測序驗證正確的LR重組質粒.用構建的慢病毒錶達載體pLenti-CMV-hPPE-U6-shRNA和包裝質粒共轉染293T細胞,包裝病毒,併測定滴度.結果經測序驗證重組質粒pENTR/U6-shRNA、pcDNA3.1(+)-hPPE和慢病毒載體pLenti-CMV-hPPE-U6-shRNA均構建成功.大鼠δ阿片受體基因小髮卡RNA及人前腦啡肽原基因雙錶達慢病毒包裝成功,病毒滴度為1×107 TU/mL.結論大鼠DOR基因小髮卡RNA及人前腦啡肽原基因雙錶達慢病毒載體構建成功,為研究DOR和hPPE在嗎啡耐受中的作用機製及探求更加閤理的鎮痛方式奠定瞭基礎.
목적 구건대서δ아편수체(delta opioid receptor,DOR)기인소발잡RNA(shRNA)급인전뇌배태원기인(human preproenkephalin gene,hPPE)쌍표체만병독재체병감정.방법 근거대서DOR mRNA서렬설계shRNA병합성포함정、반의파서렬적호보DNA련,퇴화후삽입지shRNA표체재체pENTR/U6 vector중,구건shRNA표체질립,병전화지감수태세포DH5α,추제질립후진행측서.합성hPPE기인서렬병삽입도표체재체pcDNA3.1(+)중,전화지감수태세포DH5α,도취다개단극륭진행측서험증.장hPPE삽입이구건성공적pENTR/U6-shRNA재체중,재여만병독재체pLenti7.3/V5-DEST중조,구건만병독재체pLenti-CMV-hPPE-U6-shRNA병전화DH5α감수태세포,사선양성극륭병측서험증,보류측서험증정학적LR중조질립.용구건적만병독표체재체pLenti-CMV-hPPE-U6-shRNA화포장질립공전염293T세포,포장병독,병측정적도.결과경측서험증중조질립pENTR/U6-shRNA、pcDNA3.1(+)-hPPE화만병독재체pLenti-CMV-hPPE-U6-shRNA균구건성공.대서δ아편수체기인소발잡RNA급인전뇌배태원기인쌍표체만병독포장성공,병독적도위1×107 TU/mL.결론대서DOR기인소발잡RNA급인전뇌배태원기인쌍표체만병독재체구건성공,위연구DOR화hPPE재마배내수중적작용궤제급탐구경가합리적진통방식전정료기출.
