中华检验医学杂志
中華檢驗醫學雜誌
중화검험의학잡지
CHINESE JOURNAL OF LABORATORY MEDICINE
2006年
8期
736-739
,共4页
α1-微球蛋白%毕赤酵母%基因表达
α1-微毬蛋白%畢赤酵母%基因錶達
α1-미구단백%필적효모%기인표체
目的 获得可溶、稳定、高纯度的α1-微球蛋白(α1-microglobulin,α1-MG),为临床检测标准品、质控品制备奠定基础.方法 制备构建重组人毕赤酵母真核分泌表达质粒,并对重组α1-MG进行诱导表达、纯化和鉴定.应用PCR方法扩增重组人α1-MG pET-15b质粒,得到N端带有6个组氨酸"标签"(6 × His-tag)的α1-MG融合基因,将该基因插入到真核酵母分泌表达质粒pPIC9中,筛选得到正确序列的重组分泌表达质粒pPIC9-MG、并转化毕赤酵母菌菌株GS115(Pichia pastoris GS115);用甲醇进行重组人α1-MG的诱导表达,摇瓶发酵,上清α1-MG含量测定;目的蛋白采用硫酸铵沉淀、一步亲和层析纯化并通过免疫学含量测定、PAGE电泳、Western blot以及生物质谱进行鉴定;初步进行稳定性观察.结果 成功构建了重组人α1-MG真核酵母表达载体,核酸测序与预测一致,并在毕赤酵母中实现了重组人α1-MG的分泌性表达,表达量可达73 mg/L,约占总蛋白的30%.经纯化及鉴定,得到了可溶性的、具有天然蛋白生物学活性的PAGE纯目的蛋白.结论 首次在毕赤酵母中实现重组人α1-MG的高效分泌性表达,表达目的蛋白具有良好的生物学活性、稳定性好、易纯化等优点.
目的 穫得可溶、穩定、高純度的α1-微毬蛋白(α1-microglobulin,α1-MG),為臨床檢測標準品、質控品製備奠定基礎.方法 製備構建重組人畢赤酵母真覈分泌錶達質粒,併對重組α1-MG進行誘導錶達、純化和鑒定.應用PCR方法擴增重組人α1-MG pET-15b質粒,得到N耑帶有6箇組氨痠"標籤"(6 × His-tag)的α1-MG融閤基因,將該基因插入到真覈酵母分泌錶達質粒pPIC9中,篩選得到正確序列的重組分泌錶達質粒pPIC9-MG、併轉化畢赤酵母菌菌株GS115(Pichia pastoris GS115);用甲醇進行重組人α1-MG的誘導錶達,搖瓶髮酵,上清α1-MG含量測定;目的蛋白採用硫痠銨沉澱、一步親和層析純化併通過免疫學含量測定、PAGE電泳、Western blot以及生物質譜進行鑒定;初步進行穩定性觀察.結果 成功構建瞭重組人α1-MG真覈酵母錶達載體,覈痠測序與預測一緻,併在畢赤酵母中實現瞭重組人α1-MG的分泌性錶達,錶達量可達73 mg/L,約佔總蛋白的30%.經純化及鑒定,得到瞭可溶性的、具有天然蛋白生物學活性的PAGE純目的蛋白.結論 首次在畢赤酵母中實現重組人α1-MG的高效分泌性錶達,錶達目的蛋白具有良好的生物學活性、穩定性好、易純化等優點.
목적 획득가용、은정、고순도적α1-미구단백(α1-microglobulin,α1-MG),위림상검측표준품、질공품제비전정기출.방법 제비구건중조인필적효모진핵분비표체질립,병대중조α1-MG진행유도표체、순화화감정.응용PCR방법확증중조인α1-MG pET-15b질립,득도N단대유6개조안산"표첨"(6 × His-tag)적α1-MG융합기인,장해기인삽입도진핵효모분비표체질립pPIC9중,사선득도정학서렬적중조분비표체질립pPIC9-MG、병전화필적효모균균주GS115(Pichia pastoris GS115);용갑순진행중조인α1-MG적유도표체,요병발효,상청α1-MG함량측정;목적단백채용류산안침정、일보친화층석순화병통과면역학함량측정、PAGE전영、Western blot이급생물질보진행감정;초보진행은정성관찰.결과 성공구건료중조인α1-MG진핵효모표체재체,핵산측서여예측일치,병재필적효모중실현료중조인α1-MG적분비성표체,표체량가체73 mg/L,약점총단백적30%.경순화급감정,득도료가용성적、구유천연단백생물학활성적PAGE순목적단백.결론 수차재필적효모중실현중조인α1-MG적고효분비성표체,표체목적단백구유량호적생물학활성、은정성호、역순화등우점.
