生物工程学报
生物工程學報
생물공정학보
CHINESE JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY
2008年
1期
117-123
,共7页
邹贤刚%袁三平%鲜建%赵雅琳%李狄尔%王玉阁%郝茹%解居伦%刘身庆%杜淼
鄒賢剛%袁三平%鮮建%趙雅琳%李狄爾%王玉閣%郝茹%解居倫%劉身慶%杜淼
추현강%원삼평%선건%조아림%리적이%왕옥각%학여%해거륜%류신경%두묘
山羊%乳腺生物发应器%转基因%克隆%重组人的抗凝血酶Ⅲ(rhATⅢ)%胎儿成纤维细胞(FFC)
山羊%乳腺生物髮應器%轉基因%剋隆%重組人的抗凝血酶Ⅲ(rhATⅢ)%胎兒成纖維細胞(FFC)
산양%유선생물발응기%전기인%극륭%중조인적항응혈매Ⅲ(rhATⅢ)%태인성섬유세포(FFC)
利用转基因克隆奶山羊乳腺生物反应器大量生产重组人的抗凝血酶Ⅲ(rhATⅢ)蛋白质.其中包括:筛选出人的抗凝血酶Ⅲ蛋白基因的cDNA序列;利用山羊的β-酪蛋白基因的启动区,终止信号和Enterokinase蛋白酶酶切DNA序列,构建在乳腺中特异表达rhATⅢ的表达栽体.同时在转基因载体的末端连接一个新酶素筛选基因(Neomycin).再以细胞转染、G418筛选和体细胞核移植(动物克隆)等过程,最后获得含有人的抗凝血酶Ⅲ基因的转基因克隆奶山羊.我们共获得了5个原代转基因公羊.第一只克隆羊在出生后78 d死亡,解剖表明:羊的肺部和肾脏等器官有异常.其它克隆公羊经过与崂山种母羊交配,得到转基因后代,其中两个原代转基因羊的后代母羊已成熟、所获得的奶经蛋白质电泳证明:转基因克隆羊后代奶中含有约60 kD大小的rhATⅢ糖蛋白;经Elisa检测表明:在奶中含有大量活性的rhATⅢ,在来源于两个不同克隆公羊的后代母羊奶中的rhATⅢ含量分别为0.4mg/L和3 g/L.此研究证明:转基因奶山羊可以大量地生产具有很高活性的rhATⅢ.用这种方法生产的rhATⅢ通过蛋白质提纯,制成注射针剂,将可用于人的抗凝血酶Ⅲ缺乏症的治疗、预防血栓和重大手术过程中的止血的作用等.
利用轉基因剋隆奶山羊乳腺生物反應器大量生產重組人的抗凝血酶Ⅲ(rhATⅢ)蛋白質.其中包括:篩選齣人的抗凝血酶Ⅲ蛋白基因的cDNA序列;利用山羊的β-酪蛋白基因的啟動區,終止信號和Enterokinase蛋白酶酶切DNA序列,構建在乳腺中特異錶達rhATⅢ的錶達栽體.同時在轉基因載體的末耑連接一箇新酶素篩選基因(Neomycin).再以細胞轉染、G418篩選和體細胞覈移植(動物剋隆)等過程,最後穫得含有人的抗凝血酶Ⅲ基因的轉基因剋隆奶山羊.我們共穫得瞭5箇原代轉基因公羊.第一隻剋隆羊在齣生後78 d死亡,解剖錶明:羊的肺部和腎髒等器官有異常.其它剋隆公羊經過與嶗山種母羊交配,得到轉基因後代,其中兩箇原代轉基因羊的後代母羊已成熟、所穫得的奶經蛋白質電泳證明:轉基因剋隆羊後代奶中含有約60 kD大小的rhATⅢ糖蛋白;經Elisa檢測錶明:在奶中含有大量活性的rhATⅢ,在來源于兩箇不同剋隆公羊的後代母羊奶中的rhATⅢ含量分彆為0.4mg/L和3 g/L.此研究證明:轉基因奶山羊可以大量地生產具有很高活性的rhATⅢ.用這種方法生產的rhATⅢ通過蛋白質提純,製成註射針劑,將可用于人的抗凝血酶Ⅲ缺乏癥的治療、預防血栓和重大手術過程中的止血的作用等.
이용전기인극륭내산양유선생물반응기대량생산중조인적항응혈매Ⅲ(rhATⅢ)단백질.기중포괄:사선출인적항응혈매Ⅲ단백기인적cDNA서렬;이용산양적β-락단백기인적계동구,종지신호화Enterokinase단백매매절DNA서렬,구건재유선중특이표체rhATⅢ적표체재체.동시재전기인재체적말단련접일개신매소사선기인(Neomycin).재이세포전염、G418사선화체세포핵이식(동물극륭)등과정,최후획득함유인적항응혈매Ⅲ기인적전기인극륭내산양.아문공획득료5개원대전기인공양.제일지극륭양재출생후78 d사망,해부표명:양적폐부화신장등기관유이상.기타극륭공양경과여로산충모양교배,득도전기인후대,기중량개원대전기인양적후대모양이성숙、소획득적내경단백질전영증명:전기인극륭양후대내중함유약60 kD대소적rhATⅢ당단백;경Elisa검측표명:재내중함유대량활성적rhATⅢ,재래원우량개불동극륭공양적후대모양내중적rhATⅢ함량분별위0.4mg/L화3 g/L.차연구증명:전기인내산양가이대량지생산구유흔고활성적rhATⅢ.용저충방법생산적rhATⅢ통과단백질제순,제성주사침제,장가용우인적항응혈매Ⅲ결핍증적치료、예방혈전화중대수술과정중적지혈적작용등.
