激光生物学报
激光生物學報
격광생물학보
ACTA LASER BIOLOGY SINICA
2008年
6期
824-828
,共5页
龙跃生%蔡阳林%赵绮华%廖卫平
龍躍生%蔡暘林%趙綺華%廖衛平
룡약생%채양림%조기화%료위평
融合PCR%定点诱变%SCNIA%癫痫
融閤PCR%定點誘變%SCNIA%癲癇
융합PCR%정점유변%SCNIA%전간
目的:利用结合单酶切位点的融合PCR技术对癫痫相关基因SCNIA进行定点突变.方法:首先设计两对引物PF1/PR1和PF2/PR2,PF1和PR2均位于突变位点最近的单酶切位点处,而突变位点设计在第一对反向引物(PR1)和第二对正向引物上(PF2).通过重叠延伸法两次PCR扩增:第一次用PF1/PR1和PF2/PR2分开扩增,以扩增产物作模板,PF1/PR2作引物进行融合PCR,得到的扩增产物即含有所需要的突变位点,最后将扩增片段克隆入pMD18-T载体,经测序筛选阳性克隆.结果:DNA测序表明SCN1A基因所编码的第946位密码子由精氨酸(Arg)突变为组氨酸(His),再通过酶切和连接反应将重组质粒上的突变片段替换SCN1A表达质粒上的对应片段,成功构建了SCN1A突变载体.结论:与现在常用的长距离PCR定点诱导突变相比较,结合单酶切位点的融合PCR定点突变技术具备扩增距离短的优点,大大降低了自发突变的概率,适合于大肠杆菌中易自发突变的较大载体的定点诱变.
目的:利用結閤單酶切位點的融閤PCR技術對癲癇相關基因SCNIA進行定點突變.方法:首先設計兩對引物PF1/PR1和PF2/PR2,PF1和PR2均位于突變位點最近的單酶切位點處,而突變位點設計在第一對反嚮引物(PR1)和第二對正嚮引物上(PF2).通過重疊延伸法兩次PCR擴增:第一次用PF1/PR1和PF2/PR2分開擴增,以擴增產物作模闆,PF1/PR2作引物進行融閤PCR,得到的擴增產物即含有所需要的突變位點,最後將擴增片段剋隆入pMD18-T載體,經測序篩選暘性剋隆.結果:DNA測序錶明SCN1A基因所編碼的第946位密碼子由精氨痠(Arg)突變為組氨痠(His),再通過酶切和連接反應將重組質粒上的突變片段替換SCN1A錶達質粒上的對應片段,成功構建瞭SCN1A突變載體.結論:與現在常用的長距離PCR定點誘導突變相比較,結閤單酶切位點的融閤PCR定點突變技術具備擴增距離短的優點,大大降低瞭自髮突變的概率,適閤于大腸桿菌中易自髮突變的較大載體的定點誘變.
목적:이용결합단매절위점적융합PCR기술대전간상관기인SCNIA진행정점돌변.방법:수선설계량대인물PF1/PR1화PF2/PR2,PF1화PR2균위우돌변위점최근적단매절위점처,이돌변위점설계재제일대반향인물(PR1)화제이대정향인물상(PF2).통과중첩연신법량차PCR확증:제일차용PF1/PR1화PF2/PR2분개확증,이확증산물작모판,PF1/PR2작인물진행융합PCR,득도적확증산물즉함유소수요적돌변위점,최후장확증편단극륭입pMD18-T재체,경측서사선양성극륭.결과:DNA측서표명SCN1A기인소편마적제946위밀마자유정안산(Arg)돌변위조안산(His),재통과매절화련접반응장중조질립상적돌변편단체환SCN1A표체질립상적대응편단,성공구건료SCN1A돌변재체.결론:여현재상용적장거리PCR정점유도돌변상비교,결합단매절위점적융합PCR정점돌변기술구비확증거리단적우점,대대강저료자발돌변적개솔,괄합우대장간균중역자발돌변적교대재체적정점유변.
