中国地方病学杂志
中國地方病學雜誌
중국지방병학잡지
CHINESE JOURNAL OF ENDEMIOLOGY
2003年
z1期
133
,共1页
侯秉璋%陈昆明%刘嘉玉%张墨玲%乔玲
侯秉璋%陳昆明%劉嘉玉%張墨玲%喬玲
후병장%진곤명%류가옥%장묵령%교령
甲状腺自身抗体%单链抗体%重叠延伸拼接法
甲狀腺自身抗體%單鏈抗體%重疊延伸拼接法
갑상선자신항체%단련항체%중첩연신병접법
目的甲状腺自身免疫疾病(AITD)的患者血中有多种抗甲状腺自身抗体.为了构建单链抗体(ScFv)库以获得抗甲状腺ScFv,首先需要构建ScFv基因,我们利用重叠延伸拚接(SOE)法,制备了人源ScFv基因,为建立ScFv库和进一步研究AITD的发病机制及分析甲状腺自身抗体的作用打下基础.方法分离Graves病人血中的单个核细胞.提取总RNA,逆转录合成cDNA.参照文献报道设计引物,重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的引物均采用兼并序列引物,VH5′引物和VL3′引物带有27个互补碱基的接头(linker)编码序列.VL3′引物插入Spel内切酶位点,VH5′引物插入Sacl内切酶位点.先分别通过PCR扩增VH和VL,将纯化的VH和VL扩增产物按照一定比例混合,利用VH和VL互补序列,做15次PCR循环,合成出完整的ScFv基因,再以VH3′和VL5′引物进行PCR获得更多的ScFv基因产物,将ScFv基因重组到p3SCMH噬菌粒中,并做酶切鉴定.结果用PCR扩增VH和VL基因,PCR产物做电泳鉴定,经1.5%琼脂糖凝胶电泳,在380bp和420 bp左右有特异扩增带.将VH和VL的PCR产物用低溶点胶电泳纯化,并分别做DNA定量,将VH和VL的量调整为不同的比例做SOE,制备ScFv基因.PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳显示在800 bp左右有特异扩增带.纯化后的PCR产物,用Sacl+Spel双酶消化后,重组到噬菌粒中,转入XL1-blue大肠杆菌中扩增,再以提纯的重组噬菌粒做模板以VH3′引物和VL5′引物做PCR扩增,同时对重组噬菌粒做双酶切鉴定.琼脂糖凝胶电泳显示,两种鉴定方法均在800bp处有特异条带,证明ScFv连接成功.结论构建未知亲本抗体的ScFv常采用两种方法,一种是将Linker设计在表达载体上,两端各有限制性内切酶位点供VH和VL插入;另一种方法即本文使用的SOE法.前者操作繁杂,而SOE法虽然操作相对简单但不容易成功,它要求VH和VL的量要有严格的比例.由于纯化的VH和VL做准确定量有困难,我们的体会是做SOE时将VH和VL的量以不同的比例混合,以增加成功率.一般认为Linker长度以14～25个氨基酸残基为宜.本文采用的15肽序列(Gly4Ser)3是目前使用最广泛的Linker.本实验制备的ScFv基因已经成功的构建了噬菌体抗体库,并筛选出TRAb噬菌体抗体.
目的甲狀腺自身免疫疾病(AITD)的患者血中有多種抗甲狀腺自身抗體.為瞭構建單鏈抗體(ScFv)庫以穫得抗甲狀腺ScFv,首先需要構建ScFv基因,我們利用重疊延伸抃接(SOE)法,製備瞭人源ScFv基因,為建立ScFv庫和進一步研究AITD的髮病機製及分析甲狀腺自身抗體的作用打下基礎.方法分離Graves病人血中的單箇覈細胞.提取總RNA,逆轉錄閤成cDNA.參照文獻報道設計引物,重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)的引物均採用兼併序列引物,VH5′引物和VL3′引物帶有27箇互補堿基的接頭(linker)編碼序列.VL3′引物插入Spel內切酶位點,VH5′引物插入Sacl內切酶位點.先分彆通過PCR擴增VH和VL,將純化的VH和VL擴增產物按照一定比例混閤,利用VH和VL互補序列,做15次PCR循環,閤成齣完整的ScFv基因,再以VH3′和VL5′引物進行PCR穫得更多的ScFv基因產物,將ScFv基因重組到p3SCMH噬菌粒中,併做酶切鑒定.結果用PCR擴增VH和VL基因,PCR產物做電泳鑒定,經1.5%瓊脂糖凝膠電泳,在380bp和420 bp左右有特異擴增帶.將VH和VL的PCR產物用低溶點膠電泳純化,併分彆做DNA定量,將VH和VL的量調整為不同的比例做SOE,製備ScFv基因.PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳顯示在800 bp左右有特異擴增帶.純化後的PCR產物,用Sacl+Spel雙酶消化後,重組到噬菌粒中,轉入XL1-blue大腸桿菌中擴增,再以提純的重組噬菌粒做模闆以VH3′引物和VL5′引物做PCR擴增,同時對重組噬菌粒做雙酶切鑒定.瓊脂糖凝膠電泳顯示,兩種鑒定方法均在800bp處有特異條帶,證明ScFv連接成功.結論構建未知親本抗體的ScFv常採用兩種方法,一種是將Linker設計在錶達載體上,兩耑各有限製性內切酶位點供VH和VL插入;另一種方法即本文使用的SOE法.前者操作繁雜,而SOE法雖然操作相對簡單但不容易成功,它要求VH和VL的量要有嚴格的比例.由于純化的VH和VL做準確定量有睏難,我們的體會是做SOE時將VH和VL的量以不同的比例混閤,以增加成功率.一般認為Linker長度以14～25箇氨基痠殘基為宜.本文採用的15肽序列(Gly4Ser)3是目前使用最廣汎的Linker.本實驗製備的ScFv基因已經成功的構建瞭噬菌體抗體庫,併篩選齣TRAb噬菌體抗體.
목적갑상선자신면역질병(AITD)적환자혈중유다충항갑상선자신항체.위료구건단련항체(ScFv)고이획득항갑상선ScFv,수선수요구건ScFv기인,아문이용중첩연신변접(SOE)법,제비료인원ScFv기인,위건립ScFv고화진일보연구AITD적발병궤제급분석갑상선자신항체적작용타하기출.방법분리Graves병인혈중적단개핵세포.제취총RNA,역전록합성cDNA.삼조문헌보도설계인물,중련가변구(VH)화경련가변구(VL)적인물균채용겸병서렬인물,VH5′인물화VL3′인물대유27개호보감기적접두(linker)편마서렬.VL3′인물삽입Spel내절매위점,VH5′인물삽입Sacl내절매위점.선분별통과PCR확증VH화VL,장순화적VH화VL확증산물안조일정비례혼합,이용VH화VL호보서렬,주15차PCR순배,합성출완정적ScFv기인,재이VH3′화VL5′인물진행PCR획득경다적ScFv기인산물,장ScFv기인중조도p3SCMH서균립중,병주매절감정.결과용PCR확증VH화VL기인,PCR산물주전영감정,경1.5%경지당응효전영,재380bp화420 bp좌우유특이확증대.장VH화VL적PCR산물용저용점효전영순화,병분별주DNA정량,장VH화VL적량조정위불동적비례주SOE,제비ScFv기인.PCR산물경1.5%경지당응효전영현시재800 bp좌우유특이확증대.순화후적PCR산물,용Sacl+Spel쌍매소화후,중조도서균립중,전입XL1-blue대장간균중확증,재이제순적중조서균립주모판이VH3′인물화VL5′인물주PCR확증,동시대중조서균립주쌍매절감정.경지당응효전영현시,량충감정방법균재800bp처유특이조대,증명ScFv련접성공.결론구건미지친본항체적ScFv상채용량충방법,일충시장Linker설계재표체재체상,량단각유한제성내절매위점공VH화VL삽입;령일충방법즉본문사용적SOE법.전자조작번잡,이SOE법수연조작상대간단단불용역성공,타요구VH화VL적량요유엄격적비례.유우순화적VH화VL주준학정량유곤난,아문적체회시주SOE시장VH화VL적량이불동적비례혼합,이증가성공솔.일반인위Linker장도이14～25개안기산잔기위의.본문채용적15태서렬(Gly4Ser)3시목전사용최엄범적Linker.본실험제비적ScFv기인이경성공적구건료서균체항체고,병사선출TRAb서균체항체.
