中国预防兽医学报
中國預防獸醫學報
중국예방수의학보
CHINESE JOURNAL OF PREVENTIVE VETERINARY MEDICINE
2011年
5期
358-361
,共4页
黄俊华%贺番%孙元%张鑫%常天明%李宏宇%仇华吉
黃俊華%賀番%孫元%張鑫%常天明%李宏宇%仇華吉
황준화%하번%손원%장흠%상천명%리굉우%구화길
逆转录病毒载体%T7RNA聚合酶%稳定细胞系
逆轉錄病毒載體%T7RNA聚閤酶%穩定細胞繫
역전록병독재체%T7RNA취합매%은정세포계
为构建稳定表达T7 RNA聚合酶(RNAP)的猪肾细胞系(PK-15),本研究采用PCR方法,以E.coli BL21(DE3)细菌基因组为模板扩增T7 RNAP基因,将其克隆到逆转录病毒载体pLXSN中,构建重组质粒pLXSN-T7.采用脂质体将pLXSN-T7转染至PT67细胞中,经G418筛选培养获得重组逆转录病毒rMLV-T7,将其接种于PK-15细胞进行G418加压筛选和纯化;应用PCR、间接免疫荧光试验及T7启动子控制下的红色荧光蛋白的重组表达质粒(pET-RED)进行瞬时表达,检测T7 RNAP的表达及活性,结果表明筛选所得的细胞系PK/T7的不同代次均具有转录活性.本研究建立稳定表达T7 RNAP的细胞系PK/T7,为实现细胞内T7启动的转录和猪源RNA病毒等的反向遗传操作提供了有效的方法.
為構建穩定錶達T7 RNA聚閤酶(RNAP)的豬腎細胞繫(PK-15),本研究採用PCR方法,以E.coli BL21(DE3)細菌基因組為模闆擴增T7 RNAP基因,將其剋隆到逆轉錄病毒載體pLXSN中,構建重組質粒pLXSN-T7.採用脂質體將pLXSN-T7轉染至PT67細胞中,經G418篩選培養穫得重組逆轉錄病毒rMLV-T7,將其接種于PK-15細胞進行G418加壓篩選和純化;應用PCR、間接免疫熒光試驗及T7啟動子控製下的紅色熒光蛋白的重組錶達質粒(pET-RED)進行瞬時錶達,檢測T7 RNAP的錶達及活性,結果錶明篩選所得的細胞繫PK/T7的不同代次均具有轉錄活性.本研究建立穩定錶達T7 RNAP的細胞繫PK/T7,為實現細胞內T7啟動的轉錄和豬源RNA病毒等的反嚮遺傳操作提供瞭有效的方法.
위구건은정표체T7 RNA취합매(RNAP)적저신세포계(PK-15),본연구채용PCR방법,이E.coli BL21(DE3)세균기인조위모판확증T7 RNAP기인,장기극륭도역전록병독재체pLXSN중,구건중조질립pLXSN-T7.채용지질체장pLXSN-T7전염지PT67세포중,경G418사선배양획득중조역전록병독rMLV-T7,장기접충우PK-15세포진행G418가압사선화순화;응용PCR、간접면역형광시험급T7계동자공제하적홍색형광단백적중조표체질립(pET-RED)진행순시표체,검측T7 RNAP적표체급활성,결과표명사선소득적세포계PK/T7적불동대차균구유전록활성.본연구건립은정표체T7 RNAP적세포계PK/T7,위실현세포내T7계동적전록화저원RNA병독등적반향유전조작제공료유효적방법.
